Cải thiện chứng tự kỷ, trầm cảm, tập trung trong công việc

Thông tin nghiên cứu 

Autism spectrum disorder 

Autism 

Immune system 

Immune therapy 

Neuroimmune alterations 

Tổng quan 

Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một trong những rối loạn phát triển thần kinh phổ biến nhất mà không có thuốc điều trị các triệu chứng cốt lõi và không có dấu ấn sinh học được xác nhận để sử dụng trong lâm sàng. Các sulforaphane đa chức năng phytochemical ảnh hưởng đến nhiều bất thường sinh hóa liên quan đến ASD. Chúng tôi đã nghiên cứu các chỉ thị phân tử tiềm năng từ ba con đường sinh lý liên quan đến ASD có thể bị ảnh hưởng bởi sulforaphane: chuyển hóa oxy hóa khử / stress oxy hóa; phản ứng sốc nhiệt; và rối loạn điều hòa / viêm miễn dịch, trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ những người hiến tặng khỏe mạnh và bệnh nhân mắc ASD. 

Đầu tiên, chúng tôi phân tích mức mRNA của các chỉ thị phân tử được chọn để phản ứng với sulforaphane ex vivođiều trị PBMC từ những người hiến tặng khỏe mạnh bằng PCR định lượng thời gian thực. Tất cả các điểm đánh dấu được thử nghiệm đều cho thấy khả năng định lượng, độ chính xác và khả năng tái tạo. Sau đó, chúng tôi so sánh mức độ biểu hiện của các dấu hiệu này trong PBMCs lấy từ bệnh nhân ASD để đáp ứng với sulforaphane đường uống. Mức mRNA của các enzym bảo vệ tế bào (NQO1, HO-1, AKR1C1) và protein sốc nhiệt (HSP27 và HSP70), tăng lên. Ngược lại, mức mRNA của các dấu hiệu tiền viêm (IL-6, IL-1β, COX-2 và TNF-α) giảm. Riêng lẻ thì không có chất nào đủ đặc hiệu hoặc độ nhạy, nhưng khi được nhóm theo chức năng thành hai bảng, các dấu ấn sinh học này cho thấy hứa hẹn trong việc theo dõi các phản ứng dược lực học với sulforaphane ở cả người khỏe mạnh và người tự kỷ, đồng thời cung cấp hướng dẫn cho các can thiệp y sinh. 

Giới thiệu về chủ đề nghiên cứu 

Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một trong những rối loạn phát triển thần kinh phổ biến nhất, ở Hoa Kỳ, hiện được ước tính ảnh hưởng đến 1 trong số 59 trẻ em 8 tuổi . Bất chấp nhiều thập kỷ nghiên cứu và những tiến bộ trong kiến thức của chúng ta về căn nguyên của ASD, các phương pháp điều trị và dấu ấn sinh học cho ASD vẫn còn hạn chế. Cho đến nay, chẩn đoán chính của ASD vẫn dựa vào các công cụ quan sát về bản chất là chủ quan. Các nghiên cứu về di truyền và trao đổi chất có thể cung cấp thêm manh mối về căn nguyên hoặc phương pháp điều trị cụ thể, nhưng không có dấu hiệu sinh học được chấp nhận chung cho các con đường tế bào thường bị ảnh hưởng trong ASD. 

Các nghiên cứu trong hai thập kỷ qua đã chỉ ra rằng các bất thường về sinh lý và chuyển hóa, chẳng hạn như rối loạn điều hòa miễn dịch / viêm thần kinh, mất cân bằng oxy hóa khử / stress oxy hóa, rối loạn chức năng ty thể, phơi nhiễm chất độc môi trường và rối loạn sinh học đường ruột, là những khía cạnh quan trọng của sinh lý bệnh của ASD. Kiểm tra kỹ hơn các dấu hiệu sinh học của các con đường liên quan đến ASD có thể cung cấp thông tin liên quan đến sinh lý bệnh của nó và có thể hữu ích cho việc xác định, tiên lượng và điều trị sớm. Quan trọng nhất, họ có thể hướng dẫn các chiến lược điều trị và cho phép bác sĩ lâm sàng theo dõi các phản ứng điều trị. 

Vì ASD là đa nhân tố và nhiều gen liên quan đến không có mục tiêu thuốc cụ thể, nên các chiến lược sử dụng hóa chất thực vật đa chức năng rất hấp dẫn. Sulforaphane [1-isothiocyanato-4- (methylsulfinyl) -butane, SF] là một chất hóa thực vật trong chế độ ăn uống, có nguồn gốc từ tiền chất glucoraphanin (GR) không hoạt động sinh học của nó, được tiêu thụ rộng rãi trong cây họ cải ăn được, bông cải xanh (Brassica oleracea var. Italica ). SF được tạo ra bởi hoạt động của enzyme myrosinase, có trong tế bào thực vật họ cải và thường được phân tách khỏi GR cho đến khi tế bào bị vỡ.  Myrosinase cũng được sản xuất bởi hệ vi sinh đường tiêu hóa của tất cả người khỏe mạnh.  

Trong hơn hai thập kỷ, bằng chứng về tác dụng có lợi của SF đã được tích lũy, mở rộng từ các nghiên cứu trong ống nghiệm , trên các mô hình động vật, đến một loạt các nghiên cứu lâm sàng. Điều quan trọng là hiện tại không có loại thuốc nào được chấp thuận để điều trị các triệu chứng cốt lõi của ASD, cũng như không có bất kỳ nghiên cứu nào sử dụng SF trong các mô hình chuột di truyền ASD. Tiềm năng bảo vệ tế bào của SF mở rộng ngay cả khi bổ sung chế độ ăn uống của người mẹ để ngăn ngừa chấn thương sọ não chu sinh đã được xem xét 17. Trong thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, mù đôi, đối chứng với giả dược trước đây của chúng tôi, sử dụng SF hàng ngày trong 4-18 tuần về cơ bản đã cải thiện đáng kể các bất thường về hành vi của đa số 26 nam thanh niên mắc ASD mức độ trung bình đến nặng mà không có độc tính đáng kể. 

SF là một phytochemical đa chức năng hoạt động dựa trên nhiều con đường sinh hóa và phân tử (dấu ấn sinh học) giống nhau, trong đó các bất thường được quy cho ASD, bao gồm stress oxy hóa, rối loạn chức năng ty thể và viêm thần kinh. SF là một trong những chất cảm ứng mạnh nhất tự nhiên tạo ra các enzym bảo vệ tế bào của động vật có vú thông qua con đường truyền tín hiệu liên quan đến Kelch-like ECH 1 (Keap1) / Yếu tố hạt nhân erythroid 2 liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2) / yếu tố phản ứng chống oxy hóa (ARE).  

Kích hoạt Nrf2 ngày càng được hiểu là đóng một vai trò quan trọng trong việc cải thiện nhiều bệnh, bao gồm cả rối loạn thần kinh. Điều này một phần là hậu quả của vai trò được công nhận của stress oxy hóa và viêm mãn tính là các yếu tố gây ra những rối loạn này, và Nrf2 là chất điều chỉnh chính của cân bằng nội môi oxy hóa khử tế bào và chất ức chế viêm, cả hai đều là những yếu tố quan trọng trong bệnh lý thần kinh của ASD.  

Bộ não đặc biệt dễ bị tổn thương bởi stress oxy hóa vì tiêu thụ nhiều oxy, hàm lượng axit béo không bão hòa và kim loại chuyển tiếp cao, và khả năng bảo vệ chống oxy hóa thấp. SF cũng đã cho thấy hoạt động chống viêm mạnh mẽ ở nhiều môi trường khác nhau, bao gồm các mô hình động vật bị viêm thần kinh. Hoạt động chống viêm của SF phụ thuộc một phần vào Nrf2 35 và được trung gian bổ sung thông qua việc ức chế con đường yếu tố hạt nhân-κB (NF-κB), dẫn đến giảm biểu hiện của nhiều cytokine và các yếu tố gây viêm khác. Bản thân Nrf2 cũng thể hiện hoạt tính chống viêm mạnh mẽ thông qua ít nhất ba cơ chế độc lập và quan trọng: điều chỉnh chuyển hóa oxy hóa khử; nhiễu xuyên âm với NF-κB; và điều hòa âm tính trực tiếp của các gen tiền viêm.  

Mặc dù các báo cáo giai thoại phổ biến về phản ứng sốt ở một phần đáng kể bệnh nhân tự kỷ đã được chứng thực, các cơ chế của “hiệu ứng sốt” ở bệnh nhân ASD mới bắt đầu được hiểu. Sốt có thể kích hoạt các phản ứng căng thẳng chung của tế bào, liên quan đến ít nhất hai con đường tín hiệu tế bào: con đường bảo vệ tế bào Keap1 / Nrf2 / ARE và con đường sốc nhiệt / proteasomal giúp bảo vệ chống lại nhiều loại rối loạn chức năng tế bào và hai con đường này có liên quan với nhau. SF đã được chứng minh là chất cảm ứng hiệu quả đối với một số protein sốc nhiệt (HSP) trong một số dòng tế bào người, cho thấy rằng việc kích hoạt phản ứng sốc nhiệt có thể là một yếu tố góp phần khác vào bảo vệ qua trung gian SF trong ASD. 

Để tìm kiếm các dấu ấn sinh học để theo dõi phản ứng với điều trị SF trong ASD, chúng tôi đã nghiên cứu một số dấu hiệu phân tử tiềm năng từ ba con đường sinh lý cơ bản liên quan đến ASD có thể bị ảnh hưởng bởi SF. Để tối ưu hóa phương pháp, đầu tiên chúng tôi phân lập PBMCs từ máu người tươi từ những người hiến tặng khỏe mạnh và cho những tế bào này tiếp xúc với SF ex vivo. Sau đó, chúng tôi đã kiểm tra một tập hợp con các dấu hiệu này trong PBMCs từ máu được lấy từ những đối tượng mắc ASD trước và sau 14 ngày uống hàng ngày chất bổ sung dinh dưỡng cung cấp SF, được tính toán để cung cấp xấp xỉ liều SF hàng ngày như đã được cung cấp trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Các tiêu chí được đánh giá cho các dấu ấn sinh học trong các PBMC này bao gồm khả năng định lượng, độ chính xác và khả năng tái lập của các phương pháp xét nghiệm, cũng như độ nhạy và khả năng đáp ứng đối với cảphương pháp điều trị SF in vivo và ex vivo. 

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 

Đối tượng nghiên cứu 

Đối với các thí nghiệm ex vivo, 7 người hiến tặng là người lớn khỏe mạnh đã được tuyển chọn. Máu được lấy một lần từ 5 người hiến. Hai người trong số họ được lấy máu hàng tuần, trong 3 tuần liên tiếp. Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện theo các hướng dẫn và quy định có liên quan tại Đại học Johns Hopkins và tất cả những người tham gia đều nhận được sự đồng ý trước khi lấy máu, theo một đề cương nghiên cứu được phê duyệt bởi Hội đồng đánh giá thể chế của Trường Y Đại học Johns Hopkins (NA_00036496). 

Là một nghiên cứu thí điểm cho thử nghiệm lâm sàng SF ở trẻ em mắc ASD( Clinicaltrials.gov NCT02561481), 10 nam thanh niên mắc ASD, 6-12,5 tuổi (trung bình là 9,9 tuổi) đã được tuyển dụng để đánh giá các dấu ấn sinh học dựa trên máu tiềm năng để đáp ứng để điều trị SF bằng miệng. Nghiên cứu này được thực hiện tại Trung tâm Y tế UMass Memorial và Trường Y Đại học Massachusetts, và Đại học Johns Hopkins với sự chấp thuận của Hội đồng Đánh giá Tổ chức của cả hai cơ sở (IRBH00007832 và IRB00084331). Chẩn đoán ASD mức độ trung bình đến nặng được xác nhận bằng xét nghiệm sử dụng Lịch trình quan sát chẩn đoán bệnh tự kỷ (ADOS) 76và tất cả các đối tượng đã được kiểm tra tiền sử bệnh, khám và kiểm tra phòng thí nghiệm lâm sàng bình thường sau sự đồng ý của cha mẹ. Mỗi đối tượng nhận SF dưới dạng viên Avmacol (có thể nghiền nát), mỗi viên chứa 12,5-15 mg glucoraphanin (GR, tiền chất của SF) và myrosinase có nguồn gốc thực vật hoạt động (enzym chuyển GR thành SF). Máy tính bảng đã được cung cấp cùng với COA, bởi Nutramax Laboratories, Inc. (Edgewater, Maryland, Hoa Kỳ), theo IND từ FDA Hoa Kỳ. Liều lượng đã được hiệu chỉnh thành ca. 2,2 μmol SF / kg thể trọng mỗi ngày trong 14 ngày. Các mẫu máu và nước tiểu của đối tượng được thu thập trước đó và khi kết thúc thời gian điều trị. Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện theo các hướng dẫn và quy định có liên quan tại Đại học Massachusetts và Đại học Johns Hopkins. 

Phương pháp nghiên cứu 

Thu thập mẫu máu và phân lập PBMC 

Tám mL máu toàn phần được lấy từ những người tham gia vào ống Vacutainer CPT (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) ở nhiệt độ phòng và xử lý để phân lập PBMC theo hướng dẫn từ nhà sản xuất. Tóm lại, máu trong ống CPT được ly tâm, PBMCs lơ lửng trong một lượng nhỏ huyết tương được chuyển vào ống hình nón 50 mL, và PBMCs được rửa hai lần bằng nước muối đệm phosphat. Các viên PBMC phân lập từ những người hiến tặng khỏe mạnh được đình chỉ lại trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 ấm với 10% FBS bất hoạt nhiệt để xử lý ex vivo. Viên nén PBMC phân lập từ bệnh nhân ASD được bảo quản ở -80 ° C để phân lập RNA trong tương lai. 

Xử lý PBMC ex vivo 

PBMC được phân lập từ máu của một người hiến tặng khỏe mạnh được mạ trong các đĩa 6 giếng (~ 4 × 10 6 tế bào / giếng) trong môi trường RPMI 1640 cộng với 10% FBS bất hoạt bằng nhiệt. Sau khi ủ trong 2 giờ, một số tế bào được xử lý bằng phương tiện (0,1% acetonitril) hoặc SF (2 μM và 5 μM) trong 6 giờ, hoặc tiếp xúc với phương tiện (0,1% acetonitrile) hoặc SF liều thấp (0,5 μM) nhiều lần trong 3 ngày liên tiếp. Trong khi đó, một số PBMC được tiếp xúc với xe hoặc SF trong 30 phút và sau đó là lipopolysacharide (LPS) trong 5 giờ nữa để kích thích phản ứng viêm. Sau khi xử lý, tế bào được thu thập để phân lập RNA. 

Tổng phân lập RNA và PCR định lượng thời gian thực 

Tổng số RNA tế bào được phân lập từ PBMCs bằng cách sử dụng bộ kit RNeasy mini (Qiagen, Valencia, CA, USA). Số lượng và chất lượng RNA được đo bằng máy quang phổ NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) và DNA bổ sung (1 µg) được tổng hợp bằng Bộ tổng hợp iScript cDNA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Phân tích định lượng PCR thời gian thực được thực hiện bằng Hệ thống PCR thời gian thực QuantStudio 3 của Hệ thống PCR ứng dụng (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tất cả các mồi đã được tối ưu hóa, và nồng độ mồi cuối cùng là 300 nM được sử dụng cho tất cả các phản ứng. Trình tự mồi để khuếch đại gen được trình bày trong Bảng  2. Các phản ứng được tập hợp bằng cách sử dụng 2,5 ~ 25 ng cDNA, 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Hệ thống sinh học ứng dụng, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ), mồi thuận và ngược, và nước không chứa nuclease. Biểu hiện mRNA tương đối được chuẩn hóa thành GAPDH. Biểu hiện gen được tính bằng phương pháp so sánh 2 −ΔΔCT. 

Các kết quả 

Sulforaphane gây ra biểu hiện gen bảo vệ tế bào trong PBMC của người với điều trị ex vivo 

Có một lịch sử lâu dài về các nghiên cứu cho thấy rằng ASD có liên quan đến stress oxy hóa và giảm khả năng chống oxy hóa. Các sinh vật nhân chuẩn đã phát triển các cơ chế bảo vệ hiệu quả cao, cơ chế này thường không hoạt động ở công suất tối đa, nhưng có thể được tạo ra để duy trì cân bằng nội môi oxy hóa khử tế bào và giảm stress oxy hóa bằng cách sản xuất các chất chống oxy hóa trực tiếp và bằng cách cảm ứng các enzym giải độc, chủ yếu thông qua Keap1 / Nrf2 / ARE. Nhiều bằng chứng cũng chỉ ra vai trò bảo vệ thần kinh của HSP và tính nhạy cảm tăng cao của tế bào bị tổn thương khi HSP bị ức chế. 

Để đánh giá tiềm năng sử dụng mức độ biểu hiện của một số gen bảo vệ tế bào này làm dấu ấn sinh học để điều trị ASD với SF, trước tiên chúng tôi phân tích mức mRNA của các dấu hiệu phân tử đã chọn của con đường Keap1 / Nrf2 / ARE và con đường sốc nhiệt để phản ứng với SF ex vivođiều trị trong PBMC ở người được phân lập từ những người hiến tặng khỏe mạnh. Sự biểu hiện của các dấu hiệu liên quan đến con đường Keap1 / Nrf2 / ARE, bao gồm Nrf2, Keap1, NAD (P) H: quinone oxidoreductase-1 (NQO1), heme oxygenase-1 (HO-1) và aldo-keto reductases (AKR1C1 và AKR1B10), được phân tích bằng PCR thời gian thực định lượng. NQO1, HO-1 và AKR1C1 được gây ra đáng kể khi điều trị SF 6 giờ. Thời điểm này được chọn dựa trên những quan sát trước đó của chúng tôi về động học điều hòa các gen phụ thuộc Nrf2 bởi SF và được kỳ vọng sẽ nắm bắt được sự gia tăng sản xuất mRNA của cả những người phản ứng rất nhanh (HO-1) và tương đối chậm (NQO1) 55. Điều thú vị là AKR1C1 là gen mục tiêu Nrf2 cao nhất (tăng gấp 5 lần), nhưng AKR1B10 liên quan đến chức năng thì không thể cảm ứng được. Các mức mRNA cho Keap1 tăng nhẹ, và các mức cho Nrf2 không thay đổi đáng kể để đáp ứng với điều trị SF. 

Biểu hiện của HSP70 và HSF1, hai dấu hiệu phản ứng sốc nhiệt, cũng được phân tích trong PBMC bằng PCR thời gian thực. HSP70 tăng nhẹ nhưng đáng kể khi điều trị SF, trong khi HSF1 không thay đổi. 

Đáng chú ý, không có sự phụ thuộc vào nồng độ trong cảm ứng của bất kỳ gen nào được kiểm tra, với nồng độ SF cao hơn (5 μM) thậm chí còn cho thấy tác dụng giảm nhẹ đối với việc cảm ứng AKR1C1 và NQO1. Mặc dù nồng độ này có thể đạt được trong cơ thể sống, nhưng nồng độ đỉnh điển hình hơn của SF (và các chất chuyển hóa của nó) trong huyết tương người là 1-2 μM. Để đánh giá liệu PBMC có đáp ứng với điều trị SF ex vivo liều thấp hơn, lặp lại hay không, các PBMC được phân lập từ những người hiến tặng khỏe mạnh được tiếp xúc với phương tiện (0,1% acetonitril) hoặc SF nồng độ thấp (0,5 μM) lặp lại, cứ sau 24 giờ trong 3 ngày liên tiếp, mà chúng tôi cảm thấy sẽ phù hợp hơn với tình trạng lâm sàng, mặc dù các chất chuyển hóa SF trong trường hợp này có thể không giống vớixử lý in vivo. Sáu giờ sau lần điều trị cuối cùng, các tế bào được thu thập và phân tích biểu hiện của các dấu hiệu tương tự. AKR1C1 được gây ra đáng kể khi điều trị nhiều SF liều thấp này ở mức độ tương tự như khi điều trị SF liều cao hơn, trong khi NQO1 gây ra đáng kể, nhưng ít mạnh hơn do nồng độ SF thấp hơn này. Không có gen nào khác mà chúng tôi đo được bị thay đổi đáng kể khi lặp lại các phương pháp điều trị SF liều thấp. 

Sulforaphane làm giảm biểu hiện gen tiền viêm được kích thích bởi LPS trong PBMC của người với điều trị ex vivo 

Viêm và rối loạn điều hòa miễn dịch đã được quan sát thấy cả trong não và ngoại vi ở bệnh nhân ASD. Tăng biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch, sản xuất các cytokine tiền viêm không điển hình và các yếu tố gây viêm khác, tất cả đều dẫn đến tình trạng viêm mãn tính trong hệ thần kinh trung ương và hệ miễn dịch ngoại vi của bệnh nhân ASD. Sự biểu hiện của các dấu hiệu tiền viêm có thể được điều chỉnh bởi các chất trung gian gây viêm như lipopolysaccharide nội độc tố của vi khuẩn (LPS), thông qua con đường I kappa B kinase (IκK) / NF-κB.  

Ngoài ra, thử thách LPS sau khi sinh (ở ngày thứ 5 và ngày thứ 7 sau khi sinh) đã được báo cáo là gây ra trầm cảm, giống như lo lắng, hành vi lặp đi lặp lại và suy giảm trí nhớ làm việc ở chuột đực trước tuổi vị thành niên (35 ngày tuổi) 66. Do đó, chúng tôi đã xử lý PBMCs thu được từ những người hiến tặng khỏe mạnh với 1 ng / mL hoặc 10 ng / mL LPS trong 5 giờ, sau đó, biểu hiện của các dấu hiệu chống viêm cảm ứng nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), yếu tố hoại tử khối u-α (TNF-α), interlukin-6 (IL-6) và interlukin-1β (IL-1β) được phân tích bằng PCR thời gian thực. Tất cả các dấu hiệu viêm ngoại trừ iNOS đều đáp ứng với kích thích LPS, đặc biệt là IL-6 và IL-1β (lên đến vài trăm lần), và đáp ứng tốt hơn với liều thấp hơn của LPS. Ba mươi phút trước khi điều trị bằng SF đã ức chế sự điều hòa tăng cường do LPS kích thích biểu hiện COX-2, TNF-α, IL-6 và IL-1β lên đến 80% mức kiểm soát. 

Dấu ấn sinh học cho thấy khả năng đáp ứng nhất quán đối với điều trị SF ex vivo theo thời gian trong PBMC của con người 

Để đánh giá tính nhất quán của các dấu hiệu được phân tích ở trên, PBMCs được phân lập từ máu người tươi được lấy trong ba tuần liên tiếp từ cùng một người hiến tặng khỏe mạnh. Mức độ biểu hiện gen cơ bản được phân tích trong các PBMC này. Mặc dù có sự khác biệt về mức độ mRNA của một vài dấu hiệu giữa các bộ ba lần lấy máu liên tiếp từ cùng một người hiến tặng, nhưng sự khác biệt này là không đáng kể khi so sánh với sự thay đổi lần lượt của các dấu hiệu này sau khi được kích thích. 

Một phần PBMC từ ba lần lấy máu được xử lý giống hệt nhau bằng phương tiện (0,1% acetonitril) hoặc SF trong 6 giờ, và các dấu hiệu bảo vệ tế bào của con đường Keap1 / Nrf2 / ARE và phản ứng sốc nhiệt được so sánh. Trong một môi trường thử nghiệm riêng biệt, PBMCs được phân lập từ ba lần lấy máu được đề cập ở trên được xử lý giống hệt nhau với SF trong 30 phút và sau đó LPS thêm 5 giờ, tiếp theo là so sánh các dấu hiệu chống viêm. Mặc dù có sự khác biệt giữa ba lần lấy máu lặp lại cho hầu hết các điểm đánh dấu, những khác biệt này là không đáng kể khi so sánh với sự khác biệt của các dấu hiệu này giữa trước và sau điều trị. 

Đánh giá dấu ấn sinh học trong PBMCs từ bệnh nhân ASD với điều trị SF in vivo 

Đây là một nghiên cứu thí điểm cho thử nghiệm lâm sàng về SF ở trẻ em mắc ASD( Clinicaltrials.gov NCT02561481), chúng tôi đã đánh giá các dấu ấn sinh học tương tự từ các nghiên cứu ex vivo ở 10 nam thanh niên mắc ASD, 6-12 tuổi, người đã nhận SF (dưới dạng thực phẩm bổ sung có chứa GR và myrosinase), 2,2 μmol / kg / ngày trong 14 ngày. Chúng tôi chọn loại thực phẩm chức năng này vì nó đại diện cho một nguồn SF đã được tiêu chuẩn hóa cao trên thị trường mà bệnh nhân và người chăm sóc có thể dễ dàng lấy được. Các mẫu máu và nước tiểu được thu thập trước và khi kết thúc quá trình điều trị. Thiết kế nghiên cứu này cho phép mỗi bệnh nhân tự kiểm soát. Đáng chú ý, một nhóm giả dược không được đưa vào để đánh giá dấu ấn sinh học trong nghiên cứu thử nghiệm này, bởi vì rất khó để bắt trẻ ASD lấy máu và không có nguồn SF nội sinh trong mô người, như chúng tôi đã chỉ ra trong một nghiên cứu đối chứng với giả dược trước đó. 

 Không có tác dụng phụ nghiêm trọng; một người bị cha mẹ đánh giá là hiếu động hơn, một người tăng số lần đi tiểu, hai người tăng đầy hơi, một người buồn nôn và một người phàn nàn về mùi vị khó chịu. Không có thay đổi lâm sàng nào được báo cáo bởi gia đình của 8 trong số 10 người tham gia. Cha mẹ của một đứa trẻ cho biết có nhiều giao tiếp bằng mắt và ngủ ngon, một đứa trẻ khác đã cải thiện hành vi. 

Chúng tôi đã sử dụng sự bài tiết của tổng số isothiocyanates (ITC) và các chất chuyển hóa của chúng (dithiocarbamat, DTC) trong nước tiểu để làm đại diện cho sinh khả dụng của GR được phân phối. Lấy nước tiểu theo thời gian vào cuối 14 ngày được sử dụng để xác định sự bài tiết của SF và các chất chuyển hóa của nó dưới dạng DTC bằng xét nghiệm phản ứng xyclocondensation-HPLC. Nồng độ DTC cũng được đo trong huyết tương. Nồng độ DTC liều trước không phát hiện được hoặc cực thấp trong cả mẫu nước tiểu và mẫu huyết tương chỉ ra rằng, không có bệnh nhân nào đang ăn kiêng hoặc bổ sung có chứa glucosinolate hoặc ITC, bao gồm cả SF.  

Sự chuyển đổi GR thành SF (khả dụng sinh học) được tính bằng phần trăm liều bài tiết trong các mẫu nước tiểu thu thập và được chuẩn hóa trên cơ sở tương đương mol (mol GR thành mol SF cộng với các chất chuyển hóa của nó được xác định trong phản ứng xyclocondensation). Hiệu quả chuyển đổi khác nhau giữa các đối tượng từ 8,2% đến 68,4% liều sử dụng, phù hợp với dữ liệu mà chúng tôi và những người khác đã báo cáo trước đây về khả dụng sinh học ở người lớn. Nồng độ DTC trong huyết tương sau liều có liên quan chặt chẽ với thời gian giữa liều cuối cùng và lấy máu, với mức thấp hơn ở mức dưới 2 giờ hoặc hơn 14 giờ và mức cao hơn trong khoảng 9-10 giờ sau liều cuối cùng. Ngoài ra, giá trị DTC huyết tương cho mỗi bệnh nhân có tương quan tốt với hiệu suất chuyển đổi được tính toán trong mẫu nước tiểu của họ, có tính đến thời gian giữa liều cuối cùng và lấy máu. 

Sử dụng PBMC được phân lập từ các mẫu máu của sáu trong số mười đối tượng ASD trong nghiên cứu thử nghiệm, chúng tôi so sánh mức độ biểu hiện của 9 chỉ thị phân tử liên quan đến cơ chế hoạt động của SF đã được giả định của chúng tôi. Những điểm đánh dấu này được chọn phần lớn dựa trên khả năng đáp ứng của chúng với điều trị SF ex vivo, với (a) AKR1C1, NQO1, HO-1 đóng vai trò là dấu hiệu cho con đường bảo vệ tế bào Keap1 / Nrf2 / ARE; (b) COX-2, TNF-α, IL-6 và IL-1β đóng vai trò là chất chỉ điểm cho con đường viêm; và (c) HSP70 và HSP27 đóng vai trò là điểm đánh dấu cho phản ứng sốc nhiệt. 

Nhìn chung, mức độ thay đổi của tất cả các điểm đánh dấu được kiểm tra ở in vivo nhỏ hơn ở nghiệm thức ex vivo. Mặc dù có sự khác biệt đáng kể giữa các đối tượng, sau 2 tuần uống bổ sung chế độ ăn uống này, sự biểu hiện của các gen Nrf2-target NQO1, HO-1 và AKR1C1, cũng như các dấu hiệu phản ứng sốc nhiệt HSP27 và HSP70, đã tăng lên. trong PBMCs từ bệnh nhân ASD. Ngược lại, mức độ của các dấu hiệu tiền viêm (IL-6, IL-1β, COX-2 và TNF-α) giảm. Khi sự khác biệt giữa liều trước (biểu hiện tương đối được đặt ở 1,0) và sau liều đối với tất cả các điểm đánh dấu được thử nghiệm được phân tích riêng lẻ bằng cách ghép nối hai bên t-test, chỉ có sự khác biệt trong biểu thức COX-2 là có ý nghĩa (p = 0,014). Tuy nhiên, phân nhóm theo chức năng rộng (ví dụ như bảo vệ tế bào hoặc tiền viêm), sự khác biệt so với ban đầu là rất có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% theo ANOVA (F 1,52 = 8,82, p <0,005 đối với gen bảo vệ tế bào và F 1,46 = 9,25 , p <0,004 đối với gen tiền viêm).

Phân tích và thống kê 

Tất cả các kết luận rút ra cho các nghiên cứu ex vivo đều được rút ra từ ít nhất ba thí nghiệm độc lập. Kết quả hiển thị trong Hình. 2 – 5 là trung bình ± SD của ba lần lặp lại cho mọi phản ứng PCR thời gian thực trong một thí nghiệm đại diện. Sự khác biệt giữa nghiệm thức và đối chứng được đánh giá bằng phép thử t -test của Student hai phía với p<0,05 hoặc p <0,01 lần lượt được coi là có ý nghĩa thống kê hoặc có ý nghĩa cao. Sự khác biệt giữa ba hoặc nhiều nhóm được phân tích bằng phương pháp phân tích một chiều (ANOVA). Đối với in vivo các nghiên cứu với bệnh nhân ASD, sự khác biệt giữa mức độ biểu hiện trước liều và sau liều của mỗi chất chỉ điểm được thử nghiệm được đánh giá bằng các phép thử kết hợp hai bên . Các điểm đánh dấu được nhóm được phân tích bởi ANOVA một chiều. 

Các chủ đề liên quan 

Dưới đây là một số bài viết về các chủ đề nghiên cứu có liên quan đến hoạt chất Sulforaphane và công dụng của chúng: 

• Mầm bông cải xanh giàu chất cảm ứng của các enzyme bảo vệ giúp chống lại ung thư 
• Tác dụng bảo vệ của chiết xuất bông cải xanh và Sulforaphane chống lại sự căng thẳng oxy hóa 
• Sulforaphane : Một sản phẩm tự nhiên chống lại các loại oxy phản ứng 

Tham vấn chuyên môn 

Bác sĩ 

Nguồn tham khảo: https://www.nature.com/articles/s41598-020-62714-4#Fig1