Site icon Sulforaphane

Sulforaphane cải thiện sự trao đổi chất của bệnh nhân mắc chứng run/thất điều liên quan NST X dễ gãy (FXTAS)

Sullab Admin

Sulforaphane cải thiện sự trao đổi chất của bệnh nhân mắc chứng run/thất điều liên quan NST X dễ gãy (FXTAS)

NST X dễ gãy (FXTAS) là gì? Sulforaphane có thể cải thiện chứng run/thất điều liên quan tới NST X dễ gãy hay không? Cùng tìm hiểu qua bài viết dưới đây.

Thông tin về nghiên cứu

Từ khóa:

Tổng quan  

Sự mở rộng CGG từ 55 đến 200 trong vùng 5 chưa được dịch mã của gen chậm phát triển trí tuệ do hội chứng fragile-X (FMR1) đã làm tăng nguy cơ phát triển bệnh suy nhược cơ thần kinh cơ. Từ đó dẫn đến sự khởi phát muộn hội chứng run/thất điều do NST X dễ gãy (FXTAS). Mặc dù những nghiên cứu khoa học đằng sau đột biến này, như một mô hình cho các bệnh lặp lại bộ ba nucleotide qua trung gian RNA, đã tiến triển nhanh chóng, nhưng hiện vẫn không có phương pháp điều trị nào chứng minh được hiệu quả trong việc trì hoãn sự khởi phát hoặc giảm tỷ lệ mắc bệnh, đặc biệt là ở các giai đoạn sau của bệnh. Ở đây, nghiên cứu này đã chứng minh tác dụng có lợi của hóa chất thực vật Sulforaphane (SFN), được tạo ra thông qua cách thức độc lập và phụ thuộc vào NRF2, trên các con đường liên quan đến chức năng não, cơ sinh học, phản ứng protein mở, proteosome, khả năng bảo vệ chống oxy hóa và chuyển hóa sắt trong nguyên bào sợi từ FXTAS – đối tượng bị ảnh hưởng ở tất cả các giai đoạn bệnh. Nghiên cứu này mở đường cho các nghiên cứu lâm sàng trong tương lai về việc ứng dụng SFN trong điều trị FXTAS. Ứng dụng này sẽ được chứng minh bằng việc sử dụng các thử nghiệm lâm sàng cho các các bệnh có rối loạn điều hòa NRF2 mà trong đó tuổi tác là yếu tố nguy cơ hàng đầu.

1. Giới thiệu về nghiên cứu

Tương tự với các bệnh rối loạn tâm thần kinh khác như bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, tâm thần phân liệt (Almalki và cộng sự, 2021; Dias và cộng sự, 2013; Kamal và cộng sự, 2020a; Koga và cộng sự, 2016; Sedlak và cộng sự, 2018), hội chứng Run/Thất điều liên quan đến NST X dễ gãy (FXTAS), đang chờ những biện pháp can thiệp cần thiết liên quan đến cơ chế của nó. FXTAS là một hội chứng tương đối phổ biến ở người mang mầm lão hóa, ảnh hưởng đến > 75% người mang mầm bệnh FMR1 nam ở độ tuổi 80 (Jacquemont và cộng sự, 2004) và ~ 16% nữ giới. Tuy nhiên những nghiên cứu về hội chứng này không có nhiều, chẩn đoán thiếu và ít được nghiên cứu kỹ lưỡng (Skomorowsky, 2016).

Vì FMR1 là một gen liên kết với X, và sự bất hoạt X ngẫu nhiên xảy ra ở nữ giới nên phụ nữ tương đối ít bị ảnh hưởng bởi hội chứng này. Tuy nhiên, chúng vẫn thể hiện sự không đồng nhất về kiểu hình và có thể tăng nguy cơ suy buồng trứng nguyên phát liên quan đến X dễ vỡ (FXPOI) (Berry-Kravis et al., 2005 ; Esposito et al., 2018 ; Garcia-Alegria et al., 2007 ; Hall et cộng sự, 2016 ; Jacquemont và cộng sự, 2005). Cho đến nay, không có phương pháp điều trị FXTAS cụ thể nào, mặc dù thuốc có thể cải thiện các vấn đề tâm thần và mức độ nghiêm trọng của chứng run (Napoli và cộng sự, 2019 ; Saldarriaga và cộng sự, 2016 ; Tassone và Hall, 2016 ; Wang và cộng sự, 2017)

Đây là nghiên cứu đầu tiên báo cáo sự thiếu hụt năng lượng sinh học

Nhóm của chúng tôi là nhóm đầu tiên báo cáo sự thiếu hụt năng lượng sinh học trong nhiều loại mẫu sinh học của con người thu được từ các đối tượng có nguy cơ cao mắc FXTAS (Giulivi và cộng sự, 2016 ; Napoli và cộng sự, 2011 ; Napoli và cộng sự, 2016a ; Napoli và cộng sự. , 2016b ; Ross-Inta và cộng sự, 2010 ; Song và cộng sự, 2016), cũng như trong các mô hình chuột đẻ non (Conca Dioguardi và cộng sự, 2016 ; Kaplan và cộng sự, 2012 ; Napoli và cộng sự, 2016a). Sự thiếu hụt này dẫn đến sự xuất hiện của tạp chất nội hạt nhân dương tính ubiquitin, được coi là dấu hiệu của FXTAS (Greco và cộng sự, 2002 ; Iwahashi và cộng sự, 2006), và một số tương quan với cả số lần lặp lại CGG và mức độ nghiêm trọng của kiểu hình (Napoli và cộng sự, 2011 ; Ross-Inta và cộng sự, 2010).

Dựa trên sự phụ thuộc cao của các tế bào thần kinh vào quá trình chuyển hóa ATP của ty thể và chất dẫn truyền thần kinh (Attwell và Laughlin, 2001 ; Giulivi và cộng sự, 2016 ; Laughlin và cộng sự, 1998), có khả năng sự rối loạn chức năng ty thể đã tạo ra các độc tố của protein và RNA dẫn đến sự khởi phát và tiến triển của các triệu chứng FXTAS. Mặc dù sự biểu hiện quá mức của FMRpolyG trong ống nghiệm có liên quan đến rối loạn chức năng ty thể (Gohel và cộng sự, 2019 ), không có biểu hiện FMRpolyG đáng kể nào được quan sát thấy trong các mẫu sinh học từ người mang mầm bệnh mặc dù có biểu hiện rối loạn chức năng ty thể.

Ti thể là bào quan năng động cao điều chỉnh một số chức năng sinh học khác nhau, từ sản xuất ATP đến điều hòa oxy hóa khử và quá trình apoptosis (Griffiths và Rutter, 2009 ; Wang và Youle, 2009). Ti thể cũng là nguồn tế bào chính của các loại oxy phản ứng (ROS) trong tế bào nghỉ (Giulivi và cộng sự, 1999). Do đó, việc điều chỉnh chức năng ti thể là rất quan trọng để đáp ứng nhu cầu ATP của tế bào, đồng thời giảm thiểu tác hại có thể xảy ra của ROS quá mức. Tích lũy thiệt hại do stress oxy hóa do mất cân bằng giữa sản xuất gốc tự do và chất chống oxy hóa ngày càng được đánh giá cao vì đóng góp vào sinh lý bệnh của FXTAS cũng như các rối loạn thần kinh khác . Trong bối cảnh này, nghiên cứu đã báo cáo bằng chứng về sự gia tăng sản xuất ROS của ty thể và sự tích tụ của tổn thương oxy hóa phụ thuộc vào tuổi tác [ví dụ: gia tăng sự mất đoạn mtDNA (Song và cộng sự, 2016), nitrotyrosine (Ross-Inta và cộng sự, 2010), methionine sulfoxide (Napoli và cộng sự, 2019)] trong PBMC, huyết tương và nguyên bào sợi da từ người mang có và không có FXTAS (Giulivi và cộng sự, 2016 ; Napoli và cộng sự, 2020 ; Napoli và cộng sự, 2018 ;Napoli và cộng sự, 2016b ; Song và cộng sự, 2016). Tuy nhiên, việc điều trị bằng một số chất chống oxy hóa có tính chất cụ thể trong việc giải cứu chức năng của ty thể trong nguyên bào sợi trong nuôi cấy (Song và cộng sự, 2016) cho thấy rằng việc ngăn ngừa hoặc ngăn chặn tổn thương do stress oxy hóa chỉ là một phần của câu đố phức tạp tạo nên một liệu pháp hiệu quả đối với cơ chế bệnh sinh của FXTAS.

Một nhân tố quan trọng của cân bằng nội môi oxy hóa khử là yếu tố liên quan đến yếu tố hạt nhân erythroid 2 (Nrf-2; được mã hóa bởi gen NFE2L2 hoặc NRF2 ), một protein dây kéo leucine cơ bản (bZIP) điều chỉnh sự biểu hiện qua các yếu tố phản ứng chống oxy hóa (ARE) của chất chống oxy hóa các enzym và protein tham gia vào quá trình bảo vệ xenobiotic. Trong quá trình cân bằng nội môi oxy hóa khử bình thường, được kiểm soát, mức Nrf-2 bị ức chế bởi KEAP1 – cullin-3 E3 ubiquitin ligase (Cul3) và sự suy thoái proteasomal (Cullinan và cộng sự, 2004 ; Itoh và cộng sự, 2003 ; Kobayashi và cộng sự, 2004 ; Zhang, 2006 ;Zhang và cộng sự, 2004). Các cơ chế khác nhau đã giải thích mối liên hệ giữa Nrf-2 và việc kích hoạt phản ứng chống oxy hóa. Một mặt, người ta đã đề xuất rằng ổn định stress oxy hóa và hoạt hóa Nrf-2 bằng cách giải phóng yếu tố phiên mã và bộ điều hợp chất nền Protein có nguồn gốc từ tế bào hồng cầu giống Kelch với protein tương đồng CNC (ECH) -associated 1 (KEAP1) từ Cul3 giàn giáo (Itoh và cộng sự, 1997). Gần đây hơn, người ta đã đề xuất rằng việc sửa đổi cysteine ​​thiols của Keap1 bằng chất cảm ứng ARE có thể làm thay đổi cấu trúc của phức hợp Nrf2 / Keap1 / Cul3, dẫn đến ức chế sự phổ biến Nrf- 2, do đó tạo ra một phức hợp Keap1 “chết”. Như vậy, Nrf-2 mới được tổng hợp sẽ vượt qua Keap1 và đi vào nhân để kích hoạt cảm ứng gen [xem (Ma, 2013)]. Sau đó, Nrf-2 chuyển vào nhân và gây ra sự phiên mã của các gen mục tiêu cần thiết để kiểm soát thiệt hại do stress oxy hóa đồng thời khôi phục cân bằng nội môi oxy hóa khử (Hayes và Dinkova-Kostova, 2014 ).

Song song, sự tích tụ của các protein đã mở ra (do khả năng gấp thấp hơn, các sự kiện dịch mã hoặc phiên mã, và / hoặc tăng ứng suất oxy hóa) sự kích hoạt PERK phụ thuộc vào Nrf-2, do đó làm giảm các tác động có hại của stress ER (Cullinan và cộng sự, 2004 ; Itoh và cộng sự, 2003 ; Kobayashi và cộng sự, 2004 ; Zhang, 2006 ; Zhang và cộng sự, 2004). Đáng chú ý, một quần thể con của Nrf-2 đã được mô tả là một phần của phức hợp chứa dimer KEAP1 và histidine phosphatase PGAM5 của ty thể (Lo và Hannink, 2008). Điều này rất được quan tâm vì cho thấy có ý nghĩa đối với việc duy trì và phân phối lại mạng lưới ty thể và khả năng vận động của ty thể (O’Mealey và cộng sự, 2017b), các tính năng thiết yếu của chức năng tế bào thần kinh và sự sống còn (Schwarz, 2013) đã được báo cáo là có khiếm khuyết ở chuột mô hình của việc sinh con trước (Kaplan và cộng sự, 2012).

Sulforaphane (SFN) là hóa chất thực vật mạnh mẽ trong tự nhiên. Nó có nhiều trong hạt và mầm của các cây họ cải như bông cải xanh, đã cho thấy có triển vọng trong việc chống lại chấn thương sọ não và tủy sống (Benedict và cộng sự, 2012;Dash và cộng sự, 2009) và trong quá trình điều trị nhiều bệnh khác nhau từ hen suyễn đến ung thư, các bệnh mãn tính (Cuadrado và cộng sự, 2018;Kamal và cộng sự, 2020b;Park và cộng sự, 2012) cũng như một số rối loạn tâm thần kinh ở người (Hashimoto, 2019;Klomparens và Ding, 2019;Marchezan và cộng sự, 2018;McGuinness và Kim, 2020; Michalickova và cộng sự, 2020 ; Persico và cộng sự, 2019 ; Santin-Marquez và cộng sự, 2019). Tác dụng kích hoạt của SFN trên Nrf-2 được trung gian bởi khả năng liên kết của SFN và khả năng tách chất ức chế tế bào KEAP1 của Nrf-2 (Cardozo và cộng sự, 2013 ; Keum, 2011). Do đó, SFN được kỳ vọng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự cân bằng oxy hóa khử thích hợp và bảo vệ chống lại stress oxy hóa đồng thời thúc đẩy phản ứng protein mở ra (UPR) (Fahey và Talalay, 1999) thông qua việc kích hoạt các con đường phản ứng sốc nhiệt (HSR) và ức chế liên quan đến con đường viêm NF-kB (Berry-Kravis và cộng sự, 2007 ; Dayalan Naidu và cộng sự, 2018; Dinkova-Kostova và cộng sự, 2017 ; Palliyaguru và cộng sự, 2018). Các nghiên cứu khác đã báo cáo sự gia tăng quá trình sinh học ty thể phụ thuộc SFN, ức chế autophagy và mitophagy (Briones-Herrera et al., 2018 ; Carrasco-Pozo et al., 2017 ; Lei et al., 2019 ; Negrette-Guzman et al., 2017 ; Wang và cộng sự, 2019 ; Whitman và cộng sự, 2013), cùng với việc ức chế phân hạch ty thể theo cách thức độc lập Nrf-2 (O’Mealey và cộng sự, 2017a).

Những phát hiện này đã thúc đẩy chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của SFN đối với thiệt hại liên quan đến stress oxy hóa ngoại vi. Hạn chế của kỹ thuật hình ảnh để theo dõi tình trạng chống oxy hóa não hoặc các chất chuyển hóa liên quan, và khả năng tiếp cận hạn chế đối với các mẫu não – liên quan đến các vấn đề liên quan đến nguyên nhân tử vong, bảo quản mẫu và các tác động bất lợi của khoảng thời gian sau khi khám nghiệm tử thi cũng đã thúc đẩy lĩnh vực này hướng tới việc đánh giá các dấu ấn sinh học ngoại vi để đánh giá hiệu quả tình trạng căng thẳng oxy hóa thần kinh trung ương ở một số bệnh lý thần kinh (Giulivi và cộng sự, 2016), tâm thần kinh (Carvalho và cộng sự, 2020 ; Sedlak và cộng sự, 2018), và rối loạn phát triển thần kinh (Frye và cộng sự. , 2013 ; Giulivi và cộng sự, 2010; Liu và cộng sự, 2020).

Việc đánh giá hóa sinh ty thể cũng như các liệu pháp giả định trong mô hình tế bào, chẳng hạn như nguyên bào sợi thu được mà không cần các thủ thuật xâm lấn lớn (Bernier và cộng sự, 2002 ; Kuznetsov và cộng sự, 2008 ; Schapira, 1998) là có giá trị vì các khiếm khuyết trong ty thể năng lượng sinh học không chỉ giới hạn trong não (Fischer và cộng sự, 1985) mà chúng có thể có nguồn gốc từ biểu bì thần kinh làm cho chúng trở thành proxy phù hợp của các mô não (de Arruda Cardoso Smith và cộng sự, 2004 ; Hentschel và cộng sự, 2021 ; Rieske và cộng sự ., 2005). Như đã báo cáo, tâm thần phân liệt và ASD (Coppola và cộng sự, 2008 ; Gardiner và cộng sự, 2012 ; Glatt và cộng sự, 2012 ; Jasinska và cộng sự, 2009 ; Kong và cộng sự, 2012 ; Lai và cộng sự, 2011 ; Mellios và Sur, 2012 ; Padmos và cộng sự, 2008 ; Scherzer và cộng sự, 2007 ; Shi và cộng sự, 2012 ; Sullivan và cộng sự, 2006 ; Washizuka và cộng sự, 2009), các dấu ấn sinh học ngoại vi có biểu hiện chung đối với những người có não bộ trưởng thành, đã nổi lên trong suốt nhiều năm như một công cụ tiên lượng có giá trị (Mitchell và cộng sự, 2008). Điều này, và thực tế là cơ chế sinh bệnh của FXTAS cũng rõ ràng trong rối loạn điều hòa toàn thân (không phải CNS) (bao gồm cả sự hình thành các tạp chất trong nhân (Buijsen và cộng sự, 2014 ; Hunsaker và cộng sự, 2011), chứng minh việc sử dụng nguyên bào sợi làm vật thay thế là phù hợp để điều tra các bất thường tế bào thần kinh.

Các nghiên cứu riêng của chúng tôi báo cáo rằng các triệu chứng lâm sàng (trầm cảm, chức năng điều hành thấp hơn và lo lắng) có liên quan đến sự thiếu hụt năng lượng sinh học trong PBMC từ những người mang mầm NST dễ vỡ ở tuổi trưởng thành (Napoli và cộng sự, 2016a), trong khi rối loạn chức năng ty thể được quan sát thấy ở nguyên bào sợi của trẻ em có bất thường hành vi thần kinh. ( Napoli và cộng sự, 2018 ).

Dựa trên các nghiên cứu ở trên về việc sử dụng SFN trong nhiều loại bệnh đặc trưng bởi rối loạn chức năng ty thể, chúng tôi đã kiểm tra tác động của SFN trên nguyên bào sợi da sơ cấp từ những người mang bệnh bị ảnh hưởng bởi FXTAS (phần lớn với FXTAS giai đoạn 3 trở lên), sử dụng cả proteomic và cách tiếp cận từ chức năng.

2. Nguyên liệu và phương pháp

2.1. Đặc điểm của các đối tượng đăng ký tham gia nghiên cứu 

Nhóm nghiên cứu được đặt tên là “không mang mầm bệnh” bao gồm các nguyên bào sợi sơ cấp ở da từ các cá thể nam và các cá thể phù hợp với độ tuổi (Bảng 1). Số lần lặp lại CGG của các nguyên bào sợi từ nhóm FXTAS đều trên 100 (trung bình, IQR = 105, 101–109) được xác định như đã mô tả trước đây (Filipovic-Sadic và cộng sự, 2010). Nhóm nghiên cứu là một tập hợp con của một dự án lớn hơn (được đặt tên là kiểu gen-kiểu hình 4 hoặc GP4) bao gồm 100 bệnh nhân mắc FXTAS, bao gồm 60 nam và 40 nữ trong độ tuổi từ 55 đến 85 và được phân bổ đồng đều trên tất cả các giai đoạn của FXTAS (các giai đoạn 2 đến 5) được tuyển dụng thông qua Trung tâm Nghiên cứu và Điều trị Fragile X tại Viện MIND tại Đại học California, Davis. 

Vì việc sinh con xảy ra ở tất cả các nhóm dân tộc và chủng tộc đã được nghiên cứu cho đến nay bao gồm người gốc Tây Ban Nha, người Mỹ gốc Phi, người châu Á, thổ dân Hawaii, Philippines và Úc, nên không có nhóm chủng tộc hoặc sắc tộc nào bị loại trừ trong quá trình tuyển dụng. Việc tuyển dụng người thiểu số phản ánh tỷ lệ đại diện của họ ở Hoa Kỳ, mặc dù chúng tôi không chủ động loại trừ những đối tượng không nói tiếng Anh, mẫu chấp thuận IRB được viết bằng tiếng Anh và hầu hết các bài kiểm tra tâm thần / thần kinh và các công cụ là một phần của đánh giá xác thực cho những người không nói tiếng Anh. Do hầu như tất cả các đối tượng theo GP4 đều nói tiếng Anh như ngôn ngữ chính, điều này không hạn chế việc tuyển dụng của chúng tôi. FXTAS được chẩn đoán dựa trên các tiêu chí đã báo cáo trước đây (Hagerman và Hagerman, 2016; Jacquemont và cộng sự, 2003). Nghiên cứu đã được IRB tại UCD phê duyệt và tất cả các đối tượng trong nghiên cứu này đã ký một sự đồng ý được IRB phê duyệt.

Bảng 1. Đặc điểm nhân khẩu học và lâm sàng của các cá thể mà từ đó các nguyên bào sợi da sơ cấp được nuôi cấy đã được thu nhận và sử dụng trong nghiên cứu này.

Study cohort Age (y) FXTAS Diagnosis FXTAS Stage
Control 1* 59 NA NA
Control 2* 61 NA NA
Control 3 62 NA NA
Control 4* 63 NA NA
Control 5* 67 NA NA
FXTAS 1* 50 Possible 0
FXTAS 2* 52 Possible 0
FXTAS 3* 58 Definite 4
FXTAS 4* 60 Probable 3
FXTAS 5* 62 Definite 3
FXTAS 6 67 Probable 3
FXTAS 7 67 Definite 4
FXTAS 8 67 Definite 4
FXTAS 9* 67 Probable 3
FXTAS 10* 69 Definite 5
FXTAS 11 69 Probable 3
FXTAS 12 70 Probable 2.5
FXTAS 13* 71 Definite 4

Đối với phép so sánh FXTAS-không mang: tất cả các mẫu được sử dụng để đánh giá khí sinh học và các mẫu được đánh dấu * được sử dụng cho proteomics như trong Hình 1 . In đậm, tập hợp con gồm 6 mẫu từ các đối tượng bị ảnh hưởng bởi FXTAS được sử dụng để đánh giá việc xử lý sulforaphane thông qua các xét nghiệm tăng sinh sinh học và xác định proteomics. NA, không áp dụng.

2.2. Điều kiện nuôi cấy tế bào và điều trị bằng Sulforaphane

Nguyên bào sợi được lấy từ sinh thiết da của những người tham gia được thực hiện như đã mô tả trước đây ( Napoli và cộng sự, 2011 ) được phân lập từ cùng một vùng da (sinh thiết đấm ở lưng trên bên trái) để giảm thiểu sự khác biệt do cơ địa hoặc sự tiếp xúc khác nhau với mô bên ngoài và phát triển đến 75 đến 80% hợp lưu để đánh giá kết quả ti thể hoặc phân tích proteomics .

Số lượng ô đi qua được sử dụng cho tất cả các phép đo là 4–6. Tế bào được nuôi trong dung dịch 1: 1 của AmnioMAX-C100 và RPMI-1640 Basal Medium được bổ sung với 10% huyết thanh bò thai (Invitrogen), 1 × penicillin / streptomycin / glutamine (Invitrogen), 1% axit amin không thiết yếu (Invitrogen ), và 1: 250 Mushizone (JR Scientific, Woodland, CA, USA) như đã mô tả trước đây ở những nơi khác. Đối với việc xử lý bằng sulforaphane , một tập hợp con gồm 6 dòng tế bào (được chỉ ra trong Bảng 1) được phát triển ở mức hợp lưu ~ 50% và được xử lý bằng 5 μM sulforaphane hoặc phương tiện (DMSO, 0,01%) trong 72 giờ và, nếu được chỉ định, trong 96 giờ , tách ra bằng trypsinization (ThermoFisher Scientific) và được đánh giá khả năng tồn tại bằng trypan bluevới bộ đếm tế bào TC20 (BioRad).

2.3. Kết quả của ti thể

Nguyên bào sợi thấm Digitonin được sử dụng để phân tích phân cực về cơ bản như đã mô tả trước đây (Giulivi và cộng sự, 2010; Napoli và cộng sự, 2016a). Một cách ngắn gọn, 2,0–3,0 × 10 6 tế bào đã được thêm vào buồng oxy trong 0,3 ml dung dịch đệm hô hấp có chứa 0,22 M sucrose, 50 mM KCl, 1 mM EDTA , 10 mM KH 2 PO 4 và 10 mM HEPES , pH 7,4. Tỷ lệ tiêu thụ oxy được đánh giá khi có 

Hoạt động của các phân đoạn chuỗi vận chuyển điện tử riêng lẻ được đánh giá là sự khác biệt của sự hấp thụ oxy được ghi lại trước và sau khi bổ sung các chất ức chế cụ thể. Hoạt tính tổng hợp citrate được đánh giá quang phổ bằng đầu đọc vi tấm Tecan Infinite M200 được trang bị phần mềm Magellan (Áo) ở bước sóng 412 nm (Napoli và cộng sự, 2016a). Kiểm soát hô hấp tỷ lệ (RCR) được tính toán bằng tỷ số giữa tốc độ hấp thụ oxy của các tế bào nguyên vẹn được bổ sung 10 mM glucose (có trong RPMI-1640) ở Trạng thái 3u (với 2 μM carbonylcyanide – p -trifluoromethoxyphenylhydrazone, hoặc FCCP) và Trạng thái 4 (với 0,2 μM oligomycin) ( Giulivi và cộng sự, 2013 ). 

Sự sản xuất ROS / rò rỉ proton của ty thể được tính toán từ tốc độ tiêu thụ oxy kháng oligomycin và được bình thường hóa bằng hô hấp cơ bản với sự hiện diện của 10 mM glucose. {Lưu ý: Tốc độ hấp thụ oxy ở trạng thái 4 là kết quả của quá trình sản xuất anion superoxide của ty thể, quá trình phân hủy anion superoxide thành hydro peroxit bởi MnSOD, tiếp theo là quá trình dị hóa hydro peroxit qua trung gian GPX1, bao gồm sự khuếch tán của hydrogen peroxide từ ty thể, cũng như của các phản ứng tiêu thụ oxy khác không phụ thuộc vào việc sản xuất ROS. Thuật ngữ “sản xuất mtROS” được sử dụng trong nghiên cứu này nhằm phản ánh rằng phần lớn sự hấp thụ oxy ở Trạng thái 4 thể hiện sự chuyển hóa kết hợp của anion superoxide ty thể và hydrogen peroxide [~ 82% được tính toán lại từ ( Esposito và cộng sự, 2000 )].}

2.4. Phương pháp tách chiết RNA và biểu hiện gen

Phương pháp tách chiết RNA và biểu hiện gen

RNA được phân lập từ các tế bào nguyên bào sợi tươi có chứa 1 × 10 6 tế bào bằng cách sử dụng RNEasy Plus Mini Kit từ Qiagen theo quy trình của nhà sản xuất. cDNA được tổng hợp từ RNA bằng cách sử dụng kit Quantitect RT của Qiagen theo khuyến nghị của nhà sản xuất. Nồng độ RNA và cDNA được xác định bằng máy đọc đĩa Nanoquant Tecan Infinite M200 (Tecan, Áo). Hỗn hợp mồi / đầu dò được mua từ Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Các chuỗi mồi và đầu dò thương mại là độc quyền. cDNA được pha loãng thành 5 ng/μl và được dùng làm mẫu gốc cho QRTPCR. QRTPCR được thực hiện trong một máy quay nhiệt Mastercycler EP Realplex (Eppendorf, Westbury, NY). Các mẫu được dùng pipet cho vào một đĩa 96 giếng với mỗi phản ứng chứa: 6 μl TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix (Hệ thống sinh học ứng dụng), 0,2 μl hỗn hợp đầu dò mồi 20 × (Life Technologies), 0,8 μl nước không chứa nuclease, và 5 μl trong tổng số 25 ng khuôn mẫu cDNA. Khuếch đại được thực hiện bằng cách sử dụng các thông số chu kỳ sau: 2 phút ở 50 ° C, 95 ° C trong 10 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ trong 15 giây ở 95 ° C và 1 phút ở 60 ° C. 

Thời gian chu kỳ trung bình thu được bằng các dẫn xuất kép (thuật toán CalqPlex; Eppendorf, Westbury, NY) và được chỉ định là Ct. Mỗi mẫu được phân tích trong ba lần, và các đối chứng dương và âm được chạy trên mỗi đĩa. Hệ số biến động (CV) trung bình từ 0,3% trở xuống. Để xác định ổn định nhất và các điều khiển tích cực và tiêu cực đã được chạy trên mỗi tấm. Hệ số biến động (CV) trung bình từ 0,3% trở xuống. Để xác định ổn định nhất và các điều khiển tích cực và tiêu cực đã được chạy trên mỗi tấm. Hệ số biến động (CV) trung bình từ 0,3% trở xuống. Để kết quả xác định là ổn định nhất, chúng tôi sử dụng công cụ RefFinder (Xie et al., 2012) để chuẩn hóa các mục tiêu. Dựa trên xếp hạng toàn diện được khuyến nghị (Hình bổ sung 1), XRCC4 được sử dụng để chuẩn hóa toàn bộ gen mục tiêu của chúng tôi dựa trên tính nhất quán được quan sát với các thuật toán. 

Biểu hiện gen được xác định bằng phương pháp Ct so sánh sử dụng phương trình 2ΔCt

Trong đó ΔCt = Ct Target -Ct Housekeeper.

2.5. Nghiên cứu về Protein 

Các tế bào được chỉ ra trong Bảng 1 cũng như các mẫu nguyên bào sợi được xử lý bằng SFN và phương tiện được đồng nhất bằng tay trên đá ở 20 mM HEPES pH 6,8, có chứa protease và cocktail chất ức chế phosphatase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Sau đó, protein được kết tủa thêm bằng cách kết tủa axeton để cô đặc các mẫu như đã mô tả trước đây (Napoli và cộng sự, 2016a), nộp cho Cơ sở đo khối phổ UC Davis và được phân tích như được mô tả chi tiết ở nơi khác (Napoli và cộng sự, 2016a). Vì dữ liệu proteomics không được hỗ trợ bởi NIH tài trợ, các bộ dữ liệu được sử dụng và/hoặc phân tích trong nghiên cứu hiện tại được lấy từ tác giả tương ứng theo yêu cầu hợp lý.

2.6. Thống kê số liệu 

Thử nghiệm t- Student hai bên được sử dụng để so sánh các kết quả của ty thể giữa những người không mang mầm bệnh và những đối tượng bị ảnh hưởng bởi FXTAS. Sự khác biệt giữa kết quả ti thể được đánh giá trong SFN và dòng tế bào được điều trị bằng phương tiện được đánh giá bằng bài kiểm tra t – Student để so sánh theo cặp. Dữ liệu về proteomics đã được phân tích như đã mô tả trước đây (Giulivi và cộng sự, 2016; Napoli và cộng sự, 2016a). Chi tiết về phân tích thống kê được sử dụng cho từng bộ dữ liệu được báo cáo trong phần chú giải hình tương ứng.

3. Các kết quả

3.1. Ứng suất qua trung gian protein và axit nhân trong FXTAS

Chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm proteomics không được nhắm mục tiêu của nguyên bào sợi da nguyên sinh từ 8 nam giới bị ảnh hưởng bởi NST X dễ gãy (FXTAS) và 4 người không mang mầm bệnh phù hợp với độ tuổi (xem Bảng 1). Phép thử t-student không ghép đôi hai phía với phương sai bằng nhau cho thấy không có sự khác biệt về tuổi trung bình giữa hai nhóm chẩn đoán, với trung bình (SD) = 62,50 (3,41) và 61,12 (7,67), tương ứng đối với nhóm chứng ( n  = 4) và FXTAS ( n  = 8) (t (10) = 0,336, p  = 0,7442, d = 0,233). Kiểm định của Levene chỉ ra các phương sai bằng nhau ( F  = 5,056; p  = 0,2107).

Dữ liệu protein được làm sạch bằng cách sử dụng phạm vi giữa các phần tư, tiếp theo là chuẩn hóa bằng cách sử dụng giá trị trung bình của các giá trị kiểm soát được gộp chung. Kết quả của các protein được biểu hiện khác biệt, được hiển thị dưới dạng biểu đồ núi lửa (Hình 1A) và dưới dạng bản đồ nhiệt (Hình 1B), cho thấy sự phân tách rõ ràng giữa các nhóm chẩn đoán. Các protein biểu hiện khác biệt được sử dụng làm hạt giống để xác định các con đường sinh học bị ảnh hưởng. Phân tích này được thực hiện bằng cách khai thác dữ liệu với InnateDB (Breuer và cộng sự, 2013), kết hợp các đường dẫn từ một số cơ sở dữ liệu (REACTOME, KEGG, INOH, PID NCI, PID BIOCARTA và NETPATH). Các con đường khác nhau đáng kể (Benjamini-Hochberg p  <0,05) với điểm làm giàu ≥10 được thể hiện dưới Hình 1C. Trong số những phản ứng được điều chỉnh lên đó là phản ứng miễn dịch, vận chuyển ion hoặc phân tử nhỏ, phản ứng với căng thẳng, tự động, chu kỳ tế bào, chuyển hóa RNA (đặc biệt là nối mRNA) và một số con đường tín hiệu (ví dụ, interferon gamma , canxi, NF-kB, N -cadherin và tế bào chết).

Proteome khác biệt trong nguyên bào sợi da sơ cấp của những người mang bệnh FXTAS

Hình 1. Proteome khác biệt trong nguyên bào sợi da sơ cấp của những người mang bệnh FXTAS. Một biểu đồ núi lửa (A) đã hình dung các protein được biểu hiện khác biệt trong nguyên bào sợi da sơ cấp từ những người mang bệnh FXTAS so với những người không mang gen. Chấm đỏ với p -adj <0,1. Phân cụm phân cấp (được hình dung dưới dạng bản đồ nhiệt; B) được thực hiện bằng cách sử dụng làm đầu vào cho nồng độ chuẩn hóa của protein. Phân cụm được thực hiện bằng cách sử dụng thước đo khoảng cách Euclide với thuật toán phân cụm Phường theo mức độ quan trọng của phép thử t của Học sinh (với phương sai bằng nhau). Mỗi hàng đại diện cho một protein và mỗi cột đại diện cho một chủ đề. Phân tích lộ trình (C) được thực hiện với InnateDB ( Breuer và cộng sự, 2013) bằng cách sử dụng làm đầu vào các protein đó với mức thay đổi lần lượt là | 1,5 |. Chỉ hiển thị những người có p  <0,05 (Benjamini và Hochberg đã điều chỉnh giá trị p ) dựa trên cơ sở dữ liệu KEGG, REACTOME và PID NCI, INOH, PID Biocarta và NETPATH. Các giá trị số cho biết sự phong phú. Kết cục ty thể khác nhau đáng kể được báo cáo (D) đối với người mang bệnh bị ảnh hưởng bởi FXTAS ( n  = 12) so với người không mang gen phù hợp với tuổi và giới tính ( n  = 5). Giá trị của các kết quả được chuẩn hóa dựa trên mức trung bình của các đối chứng gộp chung và sau đó được biểu thị dưới dạng thay đổi log2 lần. RCR và RCRu, tỷ lệ kiểm soát hô hấp trong điều kiện phosphoryl hóa và điều kiện tách rời, tương ứng. BHI, chỉ số sức khỏe năng lượng sinh học được tính toán như mô tả trong (Chacko và cộng sự, 2014). ROS / PL: sản xuất các loài oxy phản ứng và sự rò rỉ proton được ước tính là Trạng thái 4 do oligomycin gây ra khi có mặt glucose. Giá trị p của học sinh được chỉ ra trên biểu đồ. (Để giải thích các tham chiếu đến màu sắc trong chú giải hình này, người đọc được tham khảo phiên bản web của bài viết này.)

Trong số những yếu tố được điều chỉnh giảm trong FXTAS là dịch – bao gồm phân rã qua trung gian vô nghĩa, tổ chức tế bào, chuyển hóa (bao gồm chuyển hóa Gly và Ser cũng như quá trình oxy hóa axit béo ty thể), cân bằng protein, hoạt hóa tiểu cầu và nhiều con đường tín hiệu (ví dụ, kết dính khu trú, insulin, FGFR, G-protein).

Đáng chú ý, ba con đường (Hình 1C, được biểu thị bằng dấu hoa thị), đó là hệ thống miễn dịch, xử lý và trình bày kháng nguyên và tín hiệu gamma interferon, trùng lặp với những con đường qua trung gian của trục STING-cGAS. Con đường tín hiệu này phát hiện DNA gây bệnh bằng cách kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh liên quan đến phản ứng interferon loại I mạnh chống lại nhiễm trùng vi sinh vật. Tuy nhiên, trong trường hợp này, có thể an toàn khi cho rằng cGAS cảm biến DNA đang được kích hoạt bởi nhiễm sắc thể ngoại nhân do stress nhiễm độc gen và có thể do mtDNA giải phóng từ ty thể.

Tổng hợp lại những kết quả này cho thấy căng thẳng toàn cầu gây ra bởi sự tích tụ của các protein độc hại, bị hư hỏng, cũng như RNA, được bù đắp một phần bằng quá trình chuyển đổi phụ thuộc HSF1 và điều hòa tổng hợp protein. Sự hoạt hóa đáng kể của phản ứng miễn dịch gợi ý cho nỗ lực đối phó với các thành phần tế bào bị hư hỏng không còn được tế bào nhận ra là các khối cấu tạo vì chúng thu nhận các epitop mới thông qua tổn thương oxy hóa và / hoặc gấp nếp không bình thường.

Song song, để đánh giá hậu quả của FXTAS đối với chức năng trao đổi chất và xác nhận kết quả phân tích con đường cho thấy chức năng ti thể bất thường , chúng tôi đã thực hiện đánh giá phân cực với sự có mặt của các loại nhiên liệu khác nhau (malate-glutamate, succinate, alpha-glycerophosphate, glucose-glutamine). Hoạt động của các dấu hiệu khối lượng của ty thể (citrate synthase và Complex IV) và hiệu quả liên kết giữa vận chuyển điện tử và sản xuất ATP khi có mặt glucose và glutamine cũng đã được thử nghiệm. Đối với các đánh giá về đại lượng sinh học, kiểm định t-student không ghép đôi hai phía với phương sai bằng nhau cho thấy không có sự khác biệt về tuổi trung bình giữa hai nhóm chẩn đoán, với trung bình (SD) = 62,4 (2,96) và 63,8 (1,90), tương ứng đối với nhóm chứng (n  = 5) và FXTAS ( n  = 13) ( t (16) = 0,424, p  = 0,677, d  = 0,256). Kiểm định của Levene chỉ ra các phương sai bằng nhau ( F  = 5.363; p  = 0.118). 

Một biểu đồ núi lửa (có tính đến cả sự thay đổi lần lượt và giá trị p), tỷ lệ kiểm soát hô hấp được xác định trong các điều kiện ghép nối (RCR) và ngắt kết nối (RCRu), chỉ số sức khỏe năng lượng sinh học thấp hơn (BHI, một điểm đánh dấu tổng thể cho sức khỏe của ty thể) và mức ROS cao hơn do có sự khác biệt đáng kể trong nguyên bào sợi từ 13 người mang FXTAS so với những người từ 5 nhóm chứng phù hợp về tuổi và giới tính ( Hình 1D). Sự kết hợp thấp hơn quan sát được chủ yếu là kết quả của sự gia tăng mtROS và rò rỉ proton (Trạng thái 4, được thể hiện bởi tác dụng ức chế giảm của oligomycin ức chế tổng hợp ATP) hơn là giảm ở Trạng thái 3 hoặc Trạng thái 3u. Những kết quả này chỉ ra rằng hiệu quả của chuỗi vận chuyển điện tử trong FXTAS thấp hơn so với những người không mang điện chỉ đến một cụm phức hợp bị lỗi và / hoặc tính toàn vẹn của màng.

Để hiểu rõ hơn về sự khác biệt trong quá trình tạo khí sinh học cũng như trong các con đường sinh học được đề cập ở trên, chúng tôi đã sử dụng các protein là các protein biểu hiện khác biệt ở các đối tượng bị ảnh hưởng bởi FXTAS để tiết lộ các yếu tố phiên mã chính. Dựa trên giá trị p đã điều chỉnh và điểm số kết hợp, công cụ phân tích làm giàu EnrichR (Kuleshov và cộng sự, 2016) đã xác định các lượt truy cập đáng kể nhất là FOXO1, MYOD1, NFE2L2 và REST (Hình 2).

Làm giàu yếu tố phiên mã trong FXTAS

Hình 2. Làm giàu yếu tố phiên mã trong FXTAS. Quá trình tăng sinh được thực hiện bằng cách chỉ sử dụng làm đầu vào những protein có điểm cắt là 2 và −2, sau đó lọc theo những protein có điểm tổng hợp là 100 hoặc cao hơn. Phân tích được thực hiện với EnrichR ( Kuleshov và cộng sự, 2016 ). 4 yếu tố hàng đầu được xác định dựa trên DisGeNET ( Pinero và cộng sự, 2020 ), một cơ sở dữ liệu về các mối liên quan giữa gen-bệnh. Mỗi lần tìm kiếm sau đó được lọc theo các bệnh có thành phần thần kinh trung ương và với điểm GDA cao hơn 0,02. MYO1D là yếu tố phiên mã duy nhất không có bệnh liên quan đến thần kinh trung ương. Biểu đồ Sunburst: Điểm GDA của rối loạn thần kinh trung ương (được đánh dấu từ 1 đến 12) liên quan đến NFE2L2 , FOXO1 và REST.

4 yếu tố hàng đầu này được đánh giá dựa trên cơ sở dữ liệu gen bệnh [DisGeNET ( Pinero và cộng sự, 2020 )] để xác định (các) yếu tố có mối liên quan cao hơn với các rối loạn tâm thần hoặc thần kinh trung ương (và điểm GDA> 0,01). Trong khi MYO1D bị loại trừ do không liên quan đến bất kỳ rối loạn nào liên quan đến thần kinh trung ương, trong số 3 yếu tố còn lại, Nrf-2 được đại diện nhiều nhất, do liên quan đến bệnh Alzheimer, bệnh Huntington , bệnh Parkinson , bệnh thoái hóa thần kinh , chứng teo cơ bên . bệnh xơ cứng , bệnh não , đa xơ cứng , bệnh tauopat , mất điều hòa Friedreich , sa sút trí tuệ vàthoái hóa thùy não trước (Hình 2).

Để mở rộng và xác nhận những phát hiện này, và xem xét rằng việc kích hoạt Nrf-2 không chỉ khôi phục lại sự cân bằng oxy hóa khử, chuyển hóa xenobiotics , chống lại căng thẳng và quá trình apoptosis, mà còn duy trì tính toàn vẹn của bộ gen và ty thể (Hanson và cộng sự, 2004 ; Kowaltowski và cộng sự, 2004 ; Malhotra và cộng sự, 2010), chúng tôi đã kiểm tra sự biểu hiện gen của NFE2L2 và FMR1 cũng như 23 gen khác mã hóa các protein liên quan đến quá trình sinh học ty thể và sao chép và duy trì mtDNA (Hình 3) trong nguyên bào sợi từ 4 người không mang mầm bệnh và 4 người mang PM phù hợp với giới tính và tuổi tác. Việc phân nhóm biểu hiện gen và các đối tượng được hình dung dưới dạng bản đồ nhiệt cho thấy sự phân tách rõ ràng giữa các nhóm chẩn đoán với một số gen được biểu hiện quá mức và những gen khác không được biểu hiện khi so sánh với các nhóm không mang (Hình 3 A). Trong số đó có POLG , TFB1M / 2 M, và một tiểu đơn vị của ATPase , ATP5B. Những người có biểu hiện gen thấp hơn so với không mang là NFE2L2, phù hợp với phát hiện được báo cáo ở trên (Hình 2), cùng với nguyên nhân chủ yếu của quá trình sinh học ty thể, PGC1a, ESRRA, POLG và TWNK (Hình 3B). Biểu hiện gen của NFE2L2 tương quan trực tiếp với biểu hiện gen của ND1, MYC, POLG, ESRRA và PGC1 và ngược lại với POLG2, TFB1M và ATP5B (Hình 3 C), cho thấy rằng biểu hiện gen của NFE2L2 chủ yếu tương quan với ti thể sinh sinh học và sao chép mtDNA.

Biểu hiện gen của NFE2L2 và các gen liên quan

Hình 3. Biểu hiện gen của NFE2L2 và các gen liên quan. Sự biểu hiện gen được thực hiện trên cDNA từ 4 người không mang gen và 4 người mang mầm non phù hợp với giới tính và tuổi tác. Tất cả những người hiến tặng đều là nữ [tuổi và số lần lặp lại CGG được biểu thị bằng Trung bình (SD) cho người không mang sóng mang và người mang gen: 34,5 y (4,0) và 33,5 y (2,9) p  = 0,847; Giá trị F = 1,99; p  = 0,586; 31,75 lần lặp (2,05) và 81,25 lần lặp lại (9,45); p  = 0,011; Giá trị F = 21,1; p  = 0,032)]. Biểu hiện gen đã được bình thường hóa thành của XRCC5 vì nó là gen ổn định nhất trong các mẫu này và các gen quản lý nhà giả địnhđã kiểm tra (Hình bổ sung. 1). Bản đồ nhiệt (A) thu được bằng cách sử dụng thước đo khoảng cách của Pearson với thuật toán phân cụm Phường theo mức độ quan trọng của bài kiểm tra t của Student (với phương sai bằng nhau). B. Biểu hiện gen dưới dạng log2 FC được chuẩn hóa thành mức trung bình của các đối chứng tổng hợp. Chỉ các gen khác nhau có ý nghĩa thống kê (kiểm định t của Học sinh với phương sai bằng nhau) được báo cáo. C. Mối tương quan giữa sự biểu hiện của gen NFE2L2 và của các gen khác có vai trò quan trọng trong chức năng của ti thể . Các gen được hiển thị có FDR <0,05.

3.2. Sulforaphane cải thiện kiểu hình tế bào FXTAS bao gồm cả quá trình cộng sinh sinh học ty thể

Khi SFN kích hoạt tín hiệu của Nrf-2, chúng tôi đã kiểm tra tác dụng của hợp chất này trong 72 giờ trên các nguyên bào sợi chính của tất cả các đối tượng bị ảnh hưởng bởi FXTAS, từ giai đoạn 2,5 đến 5. Liều đã chọn (5 μM) có liên quan về mặt sinh học vì nó nằm trong những người được sử dụng trong một số nghiên cứu (Bijangi-Vishehsaraei et al., 2017; Chen et al., 2018; Qazi et al., 2010; Simoes et al., 2020) cũng như trong lượng SFN trong chế độ ăn uống có trong 1 oz. của mầm bông cải xanh [~ 10 μM; tính từ (Fahey và cộng sự, 1997)].

Proteomics không mục tiêu đã được sử dụng để xác định các con đường [Hình 4; bằng cách sử dụng Pathvisio (Kutmon và cộng sự, 2015) với WikiPathways làm cơ sở dữ liệu lộ trình] và các quá trình sinh học (Hình 4; bằng cách sử dụng InnateDB) bị ảnh hưởng khác biệt bởi điều trị SFN. Đúng như dự đoán, con đường điều hòa tăng lên đáng kể nhất là Nrf-2, tiếp theo là kích hoạt tín hiệu NF-kB và TGF-β, tiếp theo là chuyển hóa sắt và NAD + , tái lọc máu, các con đường chuyển tiếp thụ thể hạt nhân, UPR và hệ thống phân tử protein parkin-ubiquitin, trong số những người khác. Trong số đó có các protein ribosom, tổn thương DNA, con đường bệnh Alzheimer.

Ảnh hưởng của sulforaphane trên các con đường và quá trình sinh học

Hình 4. Ảnh hưởng của sulforaphane trên các con đường và quá trình sinh học. Các protein biểu hiện khác biệt trong nguyên bào sợi của các đối tượng bị ảnh hưởng bởi FXTAS được điều trị với 5 μM SFN hoặc phương tiện trong 72 giờ được sử dụng làm hạt giống để đánh giá các con đường bị ảnh hưởng. Phân tích được thực hiện với PathVisio ( Kutmon và cộng sự, 2015 ) và cơ sở dữ liệu WikiPathways. Các con đường kết quả sau đó được lọc bởi những con đường có nhiều hơn 2 protein và p  <0,05. Kích thước của bong bóng thể hiện số lượng protein. Bản thể học gen “các quá trình sinh học” được thực hiện với InnateDB và sử dụng mức cắt 2 và −2 và p <0,05.

Về mặt quá trình sinh học, và phù hợp với những quá trình được đề cập ở trên trong phân tích con đường, cân bằng nội môi chất sắt, chu trình Krebs, sửa chữa DNA và tính thấm của màng ty thể được điều chỉnh, trong khi những quy trình giảm đó là phiên mã của virus, nhắm mục tiêu protein màng phụ thuộc SRP, vô nghĩa qua trung gian phân rã, dịch mã, biểu hiện gen, đường phân .

Về tác dụng của SFN trên các ngăn tế bào, người ta đã quan sát thấy sự điều hòa lên của mạng lưới ER màng ngoài ty thể (cũng là một đặc điểm của con đường cGAS-STING), ty thể, ferritin và ER. Các ngăn tế bào bị ảnh hưởng tiêu cực bởi SFN là trục chính, hạt ribonucleoprotein hoặc tế bào sợi trung gian phức tạp và chất nền hạt nhân (Hình 5A). Như dự đoán, yếu tố phiên mã bị ảnh hưởng đáng kể nhất bởi điều trị SFN là Nrf-2, tiếp theo là sự điều chỉnh tăng của NR5A1, TLX2, ESRRA, REL và MEF2.

Tác dụng của sulforaphane đối với ngăn tế bào và tác dụng tăng sinh sinh học

Hình 5. Tác dụng của sulforaphane đối với ngăn tế bào và tác dụng tăng sinh sinh học. Bản thể học gen “ngăn tế bào” (A) được thực hiện với InnateDB, sử dụng điểm cắt 2 và −2 và p  <0,05. Kích thước bong bóng thể hiện số lượng protein. Kết quả ti thể (B) được đánh giá trong nguyên bào sợi từ những người mang bệnh bị ảnh hưởng bởi FXTAS ( n  = 6) như được mô tả trong Vật liệu và phương pháp, khi điều trị với 5 μM SFN (hoặc DMSO) trong 72 giờ. Kết quả được thể hiện dưới dạng log2 FC giữa các mẫu được xử lý SFN và DMSO. C. Hồi quy tuyến tính của kết quả ti thể ở 72 và 96 giờ đối với 2 trong số các dòng tế bào FXTAS được xử lý SFN. PGiá trị thu được bằng phân tích của Pearson. D. Sơ đồ thể hiện phản ứng tế bào oxy hóa qua trung gian NFE2L2 và hoạt động phiên mã, và vị trí hoạt động giả định của SFN. Làm giàu các yếu tố phiên mã được thực hiện với InnateDB.

Những điều chỉnh thấp đó là SOX5 , SRF và NR1I3 (Hình 5 A bên trong). Đáng chú ý, Nrf-2, SRF và NF-kB (REL) cũng được tìm thấy trong FXTAS được điều chỉnh khác biệt so với không mang (Hình 2).

SFN có hiệu quả cao trong việc phục hồi chức năng ty thể của nguyên bào sợi ở mọi đối tượng bất kể giai đoạn FXTAS (Hình 5 B). Các tác động có lợi quan sát thấy ở 72 giờ vẫn còn rõ ràng ở 96 giờ với tác động lớn đến sự liên kết và rò rỉ mtROS / proton (Hình 5 C), kết quả bị ảnh hưởng nhiều nhất ở các đối tượng FXTAS (Hình 1 D).

Đáng chú ý, và phù hợp với các nghiên cứu khác (Bijangi-Vishehsaraei và cộng sự, 2017 ; Chen và cộng sự, 2018 ; Qazi và cộng sự, 2010), trong khi điều trị SFN không dẫn đến sự khác biệt đáng kể về khả năng sống sót [98 ± 1 % và 97 ± 1,1% (trung bình ± SEM); p=0,456], tỷ lệ tăng sinh cao hơn 1,2 lần ở các tế bào được xử lý bằng phương tiện và SFN [thời gian nhân đôi, trung bình ± SEM = 20 ± 1,6 và 24 ± 2,1 giờ tương ứng đối với xe và được xử lý SFN; p  = 0,020] phù hợp với bản chất tĩnh lặng hơn của các tế bào giàu ty thể so với những tế bào được điều khiển bằng đường phân như tế bào ung thư (Dando và cộng sự, 2015).

Kết hợp với nhau, SFN đã cải thiện một số con đường được ghi nhận là thiếu FXTAS theo cách thức độc lập và phụ thuộc Nrf-2, do đó điều chỉnh stress oxy hóa , chức năng ty thể, sửa chữa DNA, tăng độ thanh thải của các bào quan và đại phân tử bị hư hỏng (parkin-ubiquitin proteasomal), làm giảm protein dịch và điều hòa sự gấp protein, và bình thường hóa cân bằng nội môi của sắt.

3.3. Điều trị SFN dẫn đến sự tăng lên của các dấu hiệu liên quan đến chức năng não, sự trao đổi chất và các khớp thần kinh trong các nguyên bào sợi da sơ cấp từ những đối tượng bị ảnh hưởng bởi FXTAS

Sử dụng làm protein đầu vào được biểu hiện khác biệt khi xử lý SFN, nghiên cứu này muốn trả lời ba câu hỏi: 

Để trả lời những câu hỏi này, nghiên cứu đã sử dụng tài nguyên dựa trên bằng chứng, được chuyên gia tuyển chọn cho các nghiên cứu về chức năng khớp thần kinh và làm giàu gen SynGO ( Koopmans và cộng sự, 2019 ).

Proteome của nguyên bào sợi phụ thuộc SFN không được làm giàu đáng kể với các mục tiêu FMRP được chọn từ các nghiên cứu trên chuột và người được thu thập từ các ấn phẩm độc lập [từ (Darnell và cộng sự, 2011 ; Lubs và cộng sự, 2012) và được lọc cho FDR <0,05] khi so sánh tới một số lượng protein bằng nhau được chọn ngẫu nhiên từ danh sách gen biểu hiện độc lập ở não [gen biểu hiện não từ SynGO = 18.039 gen được lọc bởi protein biểu hiện gen = 5444 từ g: Profiler (Raudvere và cộng sự, 2019)].

Tuy nhiên, các protein tương tác FMRP CYFIP1 và NUFIP2 được điều chỉnh tăng đáng kể khi xử lý SFN (Z -scores: 3,5 và 5,1; p <0,01) mặc dù FMRP không được phát hiện trong proteome, cho thấy ảnh hưởng trực tiếp của SFN trong môi trường FMRP .

Proteome của nguyên bào sợi phụ thuộc SFN đã được làm giàu vượt mức đối với các protein được biểu hiện cụ thể trong tế bào oligodendrocytes (làm giàu 1,44 lần; p  = 0,023) và tế bào hình sao (Cahoy và cộng sự, 2008 ; Zhang và cộng sự, 2014) (làm giàu 1,35 lần; p  = 0,044) khi so sánh với một tập dữ liệu não ngẫu nhiên. Không có sự khác biệt nào đối với tế bào thần kinh, tế bào nội mô, microglia hoặc pericytes. Giả sử rằng sự chồng chéo của các protein có liên quan đến nhận dạng tế bào, những kết quả này cho thấy rằng việc điều trị bằng SFN sẽ ảnh hưởng chủ yếu đến tế bào oligodendrocytes và tế bào hình sao.

Bộ dữ liệu proteomic thu được từ quá trình xử lý SFN đã được làm giàu với các protein được chú thích cho các quá trình và ngăn tiếp hợp (Koopmans và cộng sự, 2019). Điều trị SFN ảnh hưởng chủ yếu đến vùng trước synap, đặc biệt là các túi và màng tiếp hợp (Hình 6, trên cùng). Những thay đổi này đi kèm với những thay đổi trong các lĩnh vực sau synap bao gồm sự chuyên biệt và màng của synap. Về quy trình sinh học, SFN đã sửa đổi bộ xương tế bào sau synap, dịch mã và điều chế quá trình truyền qua synap cũng như quá trình và chu trình nội soi túi synap (Hình 6 , dưới cùng).

Sulforaphane ảnh hưởng chủ yếu đến quá trình dịch và dẫn truyền sau synap

Hình 6. Sulforaphane ảnh hưởng chủ yếu đến quá trình dịch và dẫn truyền sau synap. Các protein được biểu hiện một cách khác biệt bằng cách xử lý SFN đã được đánh giá dựa trên tài nguyên dựa trên bằng chứng, được chuyên gia tuyển chọn về chức năng khớp thần kinh và các nghiên cứu làm giàu gen SynGO ( Koopmans và cộng sự, 2019).

4. Thảo luận thêm về tác động của Sulforaphane trong điều trị FXTAS

Thảo luận thêm về tác động của Sulforaphane trong điều trị FXTAS

Các chiến lược điều trị nhắm vào ty thể trực tiếp hoặc gián tiếp nên là trọng tâm chính của y học với ý tưởng rằng việc duy trì cân bằng nội môi của ty thể có thể trì hoãn sự khởi đầu của thoái hóa thần kinh cũng như sự tiến triển của bệnh. Về vấn đề này, quá trình xử lý SFN không chỉ được mô tả là chất bảo vệ khỏi phơi nhiễm chất độc (Ferber et al., 2020 ; Fuse et al., 2016 ; Priya et al., 2011 ; Singh et al., 2015 ; Yang et al., 2020) mà còn có lợi cho chức năng của ty thể trong nhiều điều kiện khác nhau, từ ung thư biểu mô phổi thực nghiệm (Priya và cộng sự, 2011), bệnh tiểu đường (Wang và cộng sự, 2019 ; Whitman và cộng sự, 2013), bệnh thận mãn tính (Choi và cộng sự, 2014).

Các tác động lên cân bằng nội môi của ty thể từ việc tăng biểu hiện của protein chu trình Krebs [ví dụ: aconitase , AKGDH, SDH ( de Oliveira et al., 2018 ; Lei et al., 2019 )] đến giảm các dấu hiệu stress oxy hóa ty thể hoặc sản xuất ROS (Briones- Herrera và cộng sự, 2018 ; Briones-Herrera và cộng sự, 2020 ; Miller và cộng sự, 2013), bao gồm cải thiện khả năng hoạt động của ty thể bằng cách điều chỉnh quá nhiều ty thể, phân bố sai lệch, phân hạch và phát sinh sinh học (Briones -Herrera và cộng sự, 2020 ; O ‘Mealey và cộng sự, 2017a ; O’Mealey và cộng sự, 2017b).

Nguyên bào sợi sơ cấp ở da từ những người mang bệnh bị ảnh hưởng bởi FXTAS so với những người không mang gen phù hợp với giới tính và tuổi tác cho thấy phản ứng miễn dịch tăng lên, có thể là kết quả của các biểu mô mới có nguồn gốc từ các protein tích lũy, RNA và DNA bị oxy hóa. Điều này được phóng đại bởi sự điều hòa giảm cân bằng protein và chức năng của ty thể, do đó hạn chế khả năng sửa chữa của tế bào. Cho rằng FMRP là một chất kìm hãm dịch mã (Darnell và cộng sự, 2011) không có gì ngạc nhiên khi quan sát thấy rằng quá trình trao đổi chất RNA được điều hòa song song với quá trình dịch mã. Do những con đường thay đổi này, chuyển từ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa đối với hô hấp kiểu Warburg đã được ghi nhận, cả hai quan sát được hỗ trợ bởi phân tích con đường và các biện pháp chức năng, phù hợp với những gì đã quan sát trước đây với PBMC và huyết tương từ những bệnh nhân bị FXTAS (Napoli và cộng sự, 2016a).

Phù hợp với giả thuyết của chúng tôi rằng một can thiệp dược lý nên sử dụng phương pháp tiếp cận đa hướng để khôi phục một số con đường bị ảnh hưởng bởi FXTAS , SFN đã cải thiện đáng kể một số con đường được xác định là đã thay đổi trong FXTAS, bao gồm một số liên quan đến chức năng não, cũng như cơ sinh học trong tế bào của các đối tượng ngay cả khi ở các giai đoạn cuối của bệnh. Điều trị SFN dẫn đến những thay đổi trong chu kỳ túi synap, tổ chức xương tế bào, điều hòa dịch mã ở synap và các quá trình trao đổi chất ATP chủ yếu ở mức sau synap, các quá trình phù hợp tốt với nhu cầu ATP cao của ty thể trong chu kỳ túi synap (Pathak và cộng sự, 2015). Phù hợp với những phát hiện này, SFN đã cải thiện tất cả các khía cạnh của chức năng ti thể trong nguyên bào sợi với sự tăng cường chính được nhận thấy ở mức độ kết hợp giữa vận chuyển điện tử và sản xuất ATP. Đây là kết quả của việc giảm sản xuất mtROS và rò rỉ proton qua trung gian SFN, do đó làm tăng hiệu quả ghép nối. Vì khớp nối thấp có liên quan đến tính toàn vẹn của màng bị lỗi và sự lắp ráp phức tạp, khớp nối cao hơn quan sát được có thể được giải thích là kết quả của sự kết hợp của các con đường độc lập và phụ thuộc Nrf-2.

4.1. Hiệu ứng qua trung gian SFN phụ thuộc Nrf2

Có thể là kết quả của FXTAS, Nrf-2 bị cô lập trong tế bào chất bởi các đại phân tử tích lũy, bị oxy hóa có hoặc không có kim loại ( Tamas và cộng sự, 2014 ), do đó ngăn chặn sự chuyển vị hạt nhân của nó và ảnh hưởng đến vai trò của nó như là các mục tiêu trung gian của chất kích hoạt ARE. Ngoài ra, những hiệu ứng này được kết hợp bởi sự biểu hiện gen thấp hơn của yếu tố phiên mã này (Hình 3) hoặc sự biểu hiện gen nằm dưới ngưỡng tổng hợp để cung cấp đầy đủ yếu tố phiên mã này.

Trong cả hai trường hợp, vì xử lý SFN dẫn đến việc khôi phục sự cân bằng oxy hóa khử phù hợp và bảo vệ chống lại stress oxy hóa, đồng thời thúc đẩy loại bỏ các protein tích lũy chưa mở ra (Fahey và Talalay, 1999) thông qua việc kích hoạt phản ứng sốc nhiệt và ức chế con đường viêm liên quan đến NF-kB (Berry-Kravis và cộng sự, 2007 ; Dayalan Naidu và cộng sự, 2018 ; Dinkova-Kostova và cộng sự, 2017 ; Palliyaguru và cộng sự, 2018) (Hình 5 D). Những hiệu ứng này có thể giúp giải phóng Nrf-2 và tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển vị vào nhân và /hoặc cải thiện sự biểu hiện gen của nó. Ví dụ, sự cải thiện trong quá trình tạo mỡ và tái tạo myelin khi xử lý SFN được quan sát trong phân tích con đường sinh học (Hình 4) nên được hiểu là sự gia tăng dự trữ lipid và tránh tổng hợp màng de novo do ít tổn thương màng hơn. Quá trình peroxy hóa lipid giảm cũng có tác động rõ ràng đến quá trình sinh học của ty thể phụ thuộc vào gradient proton thích hợp để thúc đẩy quá trình tổng hợp ATP. Về vấn đề này, sự thiếu hụt ty thể liên quan đến tuổi thường được quan sát thấy ở các rối loạn thoái hóa thần kinh ở người cao tuổi có mối liên hệ rõ ràng với con đường Nrf-2 ( Bereiter-Hahn, 2014 ; Esteras et al., 2016 ; Kubben et al., 2016 ).

Sự cải thiện khả năng phòng thủ chống oxy hóa, vận chuyển sắt và UPR được quan sát thấy khi điều trị bằng SFN có khả năng tạo lợi ích cho quá trình sinh học ty thể, kết hợp và chuyển đổi từ quá trình đường phân sang OXPHOS. Quá trình chuyển đổi cuối cùng này cũng được hỗ trợ bởi những cải thiện trong phản ứng anaplerotic, đặc biệt là việc cung cấp AKG từ con đường sinh tổng hợp Ser (Hình 4) với sự điều chỉnh tăng của PSAT mục tiêu Nrf-2 (Hình 1A). Chúng tôi có thể loại trừ khả năng rằng tác dụng có lợi của SFN đối với chức năng của ty thể là kết quả của quá trình tăng tưới máu ty thể như đã được báo cáo trước đây (O’Mealey và cộng sự, 2017a), tác động có thể giữ lại khối lượng ty thể, trái ngược với sự gia tăng đáng kể trong khối lượng ti thể được quan sát thấy trong hệ thống của chúng tôi khi điều trị bằng SFN.

4.2. Hiệu ứng qua trung gian SFN độc lập với Nrf2

Các yếu tố phiên mã khác không liên quan đến Nrf-2 cũng được điều chỉnh một cách khác biệt bởi SFN, cho thấy sự liên quan của các hiệu ứng độc lập với Nrf-2 (Greaney và cộng sự, 2016 ; O’Mealey và cộng sự, 2017a ; Zhang và cộng sự, 2019). Trong số những người được kiểm soát, chúng tôi đã xác định được NR5A1, TLX2, ESRRA, REL và MEF2.

Chất hoạt hóa phiên mã NR5A1 là rất cần thiết cho quá trình sinh steroid và tổng hợp hormone. Các đột biến gây bệnh ở NR5A1 có liên quan đến dậy thì tự phát và tăng sản xuất testosterone ở nam giới và các vấn đề sinh sản và vô kinh nguyên phát ở nữ giới (Werner và cộng sự, 2017), do đó cung cấp một liên kết tới NST FXTAS ( Berry-Kravis và cộng sự, 2005 ; Esposito và cộng sự, 2018 ; Garcia-Alegria và cộng sự, 2007 ; Hall và cộng sự, 2016 ; Jacquemont và cộng sự. , 2005 ; Leehey và cộng sự, 2008 ) và suy buồng trứng nguyên phát ( Torrealday và cộng sự, 2017).

Chất kích hoạt phiên mã TLX2 (còn được gọi là NCX , ENX và HOX11L1) cũng rất cần thiết cho sự biệt hóa bình thường của các dòng tế bào thần kinh của hệ thần kinh tự chủ trong quá trình hình thành phôi thai người để cho phép nhu động GI bình thường (Borghini và cộng sự, 2006). Hơn nữa, sự tương tác của TLX2 với TRPC tạo thành một đơn vị chức năng quan trọng trong dòng chảy Ca 2+ qua trung gian thụ thể trong tế bào thần kinh (Louhivuori và cộng sự, 2010), phù hợp với sự mất cân bằng canxi được báo cáo trong tế bào hình sao vỏ não, tế bào thần kinh có nguồn gốc từ iPSC và ở chuột mô hình của FXTAS (Cao và cộng sự, 2013 ; Liu và cộng sự, 2012 ; Robin và cộng sự, 2017).

Thụ thể hormone steroid ERR1 (ESRRA) là cơ quan điều hòa chính của quá trình chuyển hóa năng lượng thông qua sự tương tác của nó với PGC-1alpha ( Cho et al., 2013), cho thấy rằng quá trình sinh học ty thể tăng lên có thể là kết quả của việc kích hoạt phức hợp này. Sản phẩm gen của REL, proto-oncogene c-Rel, tạo phức với NF-kB dẫn đến nhiều quá trình sinh học như viêm, miễn dịch, biệt hóa, tăng trưởng tế bào, hình thành khối u và apoptosis . Trong khi sự kích hoạt hoặc ức chế phiên mã phụ thuộc vào các loại phức hợp khác nhau, có thể đáp ứng miễn dịch thấp hơn phụ thuộc SFN có thể là kết quả của quá trình này.

Cuối cùng, yếu tố tăng cường đặc hiệu của tế bào bào tử 2C, sản phẩm của gen MEF2C, là một chất hoạt hóa phiên mã đóng một vai trò thiết yếu trong học tập và trí nhớ phụ thuộc vào hồi hải mã bằng cách ức chế một số khớp thần kinh kích thích và điều chỉnh quá trình truyền qua tiếp hợp cơ bản và gợi mở. Nó cũng rất quan trọng đối với sự phát triển, phân phối và kích hoạt tế bào thần kinh trong tân vỏ não. Đáng chú ý, nó liên kết chặt chẽ với các yếu tố điều hòa gen não khác (SOX5, PBX1) liên quan đến các con đường điều tiết có thể kiểm soát các chức năng nhận thức (Berto và cộng sự, 2016). MEF2A, với 56,5% đồng nhất với MEF2C, có liên quan đến sự biệt hóa khớp thần kinh trong tế bào thần kinh hạt tiểu não, loại tế bào đã được tìm thấy bị ảnh hưởng trong các mẫu não sau khi chết của một bệnh nhân FXTAS không bị run (Robinson và cộng sự, 2020).

Trong số các yếu tố phiên mã được điều hòa không phụ thuộc vào Nrf2 là NR1I3, SRF và SOX5 đã đề cập ở trên. Sự đại diện thấp hơn của phân họ thụ thể nhân 1 thành viên nhóm I 3 (sản phẩm của gen NR1I3) có thể liên quan đến nhu cầu thấp hơn để dị hóa các đại phân tử oxy hóa nội sinh vì nó liên kết với yếu tố phản ứng xenobiotic của một số mục tiêu. Sự điều hòa yếu tố đáp ứng huyết thanh (SRF) có thể cung cấp một mô hình để cải thiện trí nhớ và độ dẻo của khớp thần kinh trong FXTAS bằng điều trị SFN. Có thể là sự căng thẳng tế bào dữ dội của RNA và độc tính của protein trong FXTAS ( Holtzman và cộng sự, 2013 ) dẫn đến việc ức chếtiềm năng lâu dài với việc kích hoạt chứng trầm cảm dài hạn ( Kim và cộng sự, 1996 ; Rowan và cộng sự, 1998 ; Xu và cộng sự, 1997 ), cho thấy rằng sự gián đoạn của con đường này có thể góp phần vào nguy cơ hình thành trí nhớ kém và suy giảm nhận thức được quan sát trong FXTAS.

5. Kết luận của nghiên cứu

Kết luận của nghiên cứu

Các nghiên cứu về chức năng và protein được thực hiện trên nguyên bào sợi da của các đối tượng bị ảnh hưởng bởi NST X dễ gãy (FXTAS), phù hợp với các con đường được xác định là đã thay đổi trong các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, cung cấp những hiểu biết cần thiết về các quá trình phân tử liên quan đến sinh bệnh của FXTAS, bao gồm vai trò của các protein và bào quan bị tổn thương tích lũy, tăng phản ứng miễn dịch, thay đổi tổ chức và chức năng của các mạch thần kinh hỗ trợ khả năng nhận thức khỏe mạnh. Những phát hiện hiện tại của chúng tôi chỉ ra SFN hóa thực vật như một biện pháp can thiệp dược lý hiệu quả cao và sẵn có (dưới dạng thực phẩm chức năng hoặc như một phần của chế độ ăn giàu rau họ cải như bông cải xanh, cải bruxen, bắp cải, súp lơ và cải xoăn (Ishida và cộng sự, 2014) để cải thiện chức năng não, chuyển hóa và cấu trúc khớp thần kinh, với vai trò tiềm năng trong việc giảm thiểu và có thể trì hoãn sự khởi phát và tiến triển của thoái hóa thần kinh ngay cả ở những người mang mầm non không có kiểu hình FXTAS rõ ràng. 

Mặc dù chúng ta không thể loại trừ khả năng suy giảm khả năng tăng cường tín hiệu Nrf-2 theo tuổi tác có thể hạn chế hiệu quả của SFN (Zhang và cộng sự, 2015), đặc biệt ở những bệnh nhân lớn tuổi nhất, đây là nghiên cứu đầu tiên cho thấy hứa hẹn có ý nghĩa trong việc sử dụng chất này hoặc các hợp chất liên quan trong điều trị in-vitro FXTAS từ những người mang mầm bệnh trong độ tuổi 67–70, tất cả đều có số lần lặp lại CGG tương đối cao (>100) và thậm chí với các giai đoạn FXTAS nâng cao.

6. Các chủ đề liên quan  

Dưới đây là một số bài viết về các chủ đề nghiên cứu có liên quan đến hoạt chất Sulforaphane và công dụng của chúng:  

7. Tham vấn chuyên môn 

Exit mobile version