Site icon Sulforaphane

Mầm bông cải xanh giàu chất cảm ứng của các enzyme bảo vệ giúp chống lại ung thư

Sullab Admin

Mầm bông cải xanh giàu chất cảm ứng của các enzyme bảo vệ giúp chống lại ung thư

Cảm ứng các enzyme bảo vệ có tính giải độc giai đoạn 2 [ví dụ: glutathione transferase, epoxit hydrolase, NAD (P) H: quinone reductase, và glucuronosyltransferase] là một chiến lược mạnh mẽ để chống lại ung thư, sự đột biến và các dạng độc tính khác của electrophiles và các dạng phản ứng của ôxy. Các nghiên cứu đã chỉ ra, việc tiêu thụ một số lượng lớn trái cây và rau quả có liên quan đến việc giảm đáng kể nguy cơ phát triển nhiều loại khối u ác tính. Điều đáng quan tâm là một số loại thực vật ăn được có chứa một lượng đáng kể các hợp chất điều chỉnh các enzyme chuyển hóa xenobiotic của động vật có vú. Do đó, thực vật ăn được thuộc họ Cruciferae và chi Brassica (ví dụ, bông cải xanh và súp lơ trắng) chứa một lượng đáng kể isothiocyanates (hầu hết ở dạng tiền chất glucosinolate của chúng). Một số trong số đó (ví dụ, sulforaphane hoặc 4-methylsulfinylbutyl isothiocyanate) là những chất cảm ứng rất mạnh của giai đoạn 2 enzyme. 

Thật bất ngờ, mầm 3 ngày tuổi của một số cây họ cải bao gồm bông cải xanh và súp lơ trắng có chứa hàm lượng glucoraphanin (glucosinolate của sulforaphane) cao hơn 10-100 lần so với các cây trưởng thành tương ứng. Chiết xuất từ ​​mầm bông cải xanh 3 ngày tuổi (chứa glucoraphanin hoặc sulforaphane là chất cảm ứng chính của enzyme) có hiệu quả cao trong việc giảm tỷ lệ mắc, đa dạng và tốc độ phát triển của khối u tuyến vú ở chuột được điều trị bằng dimethylbenz (a) anthracene. Đáng chú ý, mầm của nhiều loại súp lơ xanh chứa một lượng không đáng kể glucosinolate indole – chất chiếm ưu thế trong rau trưởng thành và có thể làm phát sinh các sản phẩm thoái hóa (ví dụ như indole-3-carbinol) có thể tăng cường sự hình thành khối u. Do đó, một lượng nhỏ mầm cây họ cải có thể bảo vệ chống lại nguy cơ ung thư hiệu quả tương đương với số lượng lớn hơn nhiều các loại rau trưởng thành cùng loại.

1. Nguyên liệu và phương pháp

1.1. Nguồn thực vật và phương pháp trồng trọt

Nguồn thực vật và phương pháp trồng trọt

Hạt giống được lựa chọn là loại không dùng thuốc trừ sâu và được thu mua thương mại. Mầm được sản xuất từ ​​hạt được khử trùng bề mặt bằng cách rửa 1 phút trong 70% ethanol, 15 phút tiếp xúc với 1,3% natri hypoclorit có chứa 0,001% chất tẩy rửa Alconox, và rửa sạch hoàn toàn bằng nước cất vô trùng. 

Bông cải xanh ( Brassica oleracea var. Italica) giống cây trồng được sử dụng là SAGA, trừ khi có quy định khác. Mầm được trồng mà không cần bổ sung chất dinh dưỡng vô trùng trên 0,7% agar hoặc trong khay có đục lỗ nghiêng (35 × 40 cm) được tưới nước với bốn chu kỳ phun nhẹ nhàng 15 giây mỗi h. 

Tất cả các loại rau mầm đều được trồng với chu kỳ quang kỳ 16 giờ sáng và 8 giờ tối và chu kỳ 25/20°C tương ứng đối với rau mầm trồng trong thạch hoặc 25°C và không đổi đối với rau mầm trồng trong khay. Mầm được thu thập một cách nhanh và nhẹ nhàng khỏi bề mặt thạch hoặc khay phun ngay trước khi chiết để giảm thiểu sự thủy phân glucosinolate bởi myrosinase nội sinh. Rau trưởng thành và đông lạnh được lấy từ các siêu thị địa phương. Các cây không chiết vào ngày thu hái được bảo quản ở -80°C.

1.2. Chiết xuất chất cảm ứng Enzyme giai đoạn 2 từ thực vật

Rau được đồng nhất với 10 thể tích hỗn hợp có thể tích bằng nhau của dimethyl sulfoxide, dimethylformamide và acetonitril (dung môi ba) duy trì ở khoảng -50°C trong bể nước đá khô / etanol. Các mẫu được đồng nhất, tùy thuộc vào kích thước mẫu, sẽ sử dụng máy đồng nhất thủy tinh, máy đồng nhất Brinkmann Polytron, hoặc máy trộn Waring. 

Các dung môi khai thác khác là metanol sôi, nước sôi, nước lạnh và axetonitril. Trong tất cả các trường hợp, chất đồng nhất được ly tâm để loại bỏ các hạt còn lại và được bảo quản ở -20°C cho đến khi phân tích.

1.3. Thanh lọc Myrosinase

Enzyme được tinh chế từ cây con Raphanus sativus (daikon) 8 ngày tuổi bằng quy trình sắc ký tuần tự để được công bố riêng. Enzyme đòi hỏi axit ascorbic 120 kDa dimeric đã được tinh chế gần 230 lần với hoạt độ cụ thể là 184 μmol sinigrin được thủy phân mỗi phút trên mỗi mg protein và được sử dụng để thủy phân glucosinolate cho các thử nghiệm hoạt tính hóa học và chất cảm ứng.

1.4. Thử nghiệm sinh học về hiệu lực của Inducer

Sự cảm ứng của Quinone reductase được đo trong các tế bào u gan ở chuột Hepa 1c1c7 phát triển trong các đĩa vi mô 96 giếng. Thông thường, 15 μl dung dịch cần thử nghiệm (trong nước, metanol, axetonitril, hoặc dung môi ba) sẽ được pha loãng thành 3,0 ml với các dung dịch pha loãng trung bình và nối tiếp được sử dụng cho các đĩa microtiter. Myrosinase tinh khiết dư thừa và 500 μM ascorbate được thêm vào mỗi giếng để đạt được sự thủy phân hoàn toàn glucosinolate. Nồng độ cuối cùng của dung môi hữu cơ là ⋜0,5% thể tích. Các sửa đổi của quy trình đã công bố bao gồm: 

Nghiên cứu biểu thị hiệu lực cảm ứng của các chất chiết xuất từ ​​thực vật dưới dạng đơn vị / g trọng lượng tươi (fr. Wt.) hoặc trọng lượng khô.

1.5. Đo Isothiocyanates và Glucosinolate

Nồng độ Isothiocyanate của các chất chiết xuất từ ​​thực vật được xác định quang phổ bằng cách cho ngưng tụ xyclo với 1,2-benzenedithiol để tạo ra 1,3-benzodithiole-2-thione (ɛ của 23.000 M −1 ⋅cm −1 ở bước sóng 365 nm). Chất chiết xuất từ ​​nước được sử dụng trực tiếp; chiết xuất dung môi hữu cơ đầu tiên được làm bay hơi đến khô và sau đó hòa tan lại trong nước. 

Glucosinolate trong các chiết xuất này được chuyển đổi định lượng thành isothiocyanates bằng cách xử lý với myrosinase tinh khiết trong 2 giờ ở 37°C và sau đó được xử lý bằng cyclocondensation. Không thể đo glucosinolate indole theo cách này vì isothiocyanates của chúng không ổn định (xem bên dưới).

1.6. Sắc ký ion đôi của Glucosinolate

Dịch chiết thực vật được sắc ký trong axetonitril / nước (1: 1, thể tích / thể tích) có chứa 5 mM tetradecylamoni bromua với tốc độ dòng 3 ml / phút, trên cột pha ngược (Whatman Partisil 10 ODS-2; 250 x 4 mm) trên hệ thống Waters HPLC được trang bị máy dò mảng diode quang. 

Sinigrin (allyl glucosinolate) được sử dụng làm chất chuẩn. Các vùng hấp thụ tích hợp tương đối ở 235 nm đối với các alkylthioglucosinolat như glucoraphanin, glucobrassicin và neoglucobrassicin lần lượt là 1,00, 1,22 và 2,70 lần, tương ứng với một lượng tương đương sinigrin.

1.7. Phương pháp ức chế sự phát triển khối u tuyến vú ở chuột

Phương pháp ức chế sự phát triển khối u tuyến vú ở chuột

Các khối u tuyến vú được tạo ra ở những con chuột Sprague – Dawley cái bằng cách cho ăn các liều DMBA 10 mg duy nhất theo phân vùng ở tuổi 50 ngày. Các chế phẩm glucosinolate hoặc isothiocyanate thu được từ mầm bông cải xanh và kiểm soát phương tiện (tất cả trong 1,0 ml Emulphor 620P và nước với thể tích bằng nhau) được sử dụng hàng ngày vào các ngày 47–51 (2 giờ trước liều DMBA vào ngày thứ 50).

1.8. Chuẩn bị thực vật

Mầm bông cải xanh ba ngày tuổi được nhúng nhanh vào 5 thể tích nước sôi và tiếp tục đun sôi trong 3 phút. Sau đó, hỗn hợp này được làm lạnh, lọc và đông khô để tạo thành bột khô.

Để điều chế glucosinolate, bột khô đã được hòa tan trong nước và phân tích hoạt tính cảm ứng cùng với hàm lượng glucosinolate và isothiocyanate. Myrosinase tinh khiết dư thừa đã được thêm vào cả hai phân tích. Sau đó, chế phẩm được pha loãng với nước và trộn với một thể tích tương đương của Emulphor 620P, sao cho 1,0 ml chứa 25 hoặc 100 μmol glucosinolate (Bảng 1).

Bảng 1: Phân tích các chế phẩm từ mầm bông cải xanh 3 ngày tuổi được sử dụng cho các nghiên cứu ức chế khối u tuyến vú ở chuột

Sự chuẩn bị​ Thử nghiệm sinh học về hoạt tính của chất cảm ứng, đơn vị / mg trọng lượng khô.​ Nồng độ của chất cảm ứng, nmol / mg trọng lượng khô.​
Tính từ xét nghiệm sinh học​ Được đo bằng lốc xoáy​
Glucosinolate​ 10.300​ 309 *​ 334​
Isothiocyanate​ 7.860​ 236 *​ 228​


Các giá trị này giả định rằng hoạt tính cảm ứng hoàn toàn bắt nguồn từ glucoraphanin thủy phân myrosinase, tức là, sulforaphane (CD = 0,2 μM, hoặc 33,3 đơn vị hoạt động cảm ứng trên một nmol). Trọng lượng khô của bột đối với liều 100 μmol lần lượt là 324 và 424 mg đối với các chế phẩm glucosinolate và isothiocyanate. 

Để điều chế isothiocyanates, loại bột được mô tả ở trên đã được trộn với 2% (trọng lượng / trọng lượng) (dựa trên giá trị ban đầu của mầm bông cải xanh) mầm daikon (Raphanus sativus) 9 ngày tuổi như một nguồn thô dồi dào myrosinase. Hỗn hợp được đồng nhất và ủ trong 3 giờ ở 37°C, dẫn đến chuyển đổi định lượng glucosinolate thành isothiocyanates. Nó đã được lọc, đông khô và xét nghiệm về hoạt tính của chất cảm ứng và hàm lượng isothiocyanate. Daikon được thêm vào chỉ chiếm ít hơn 1% hàm lượng isothiocyanate và tổng hoạt tính cảm ứng. Sau đó, chế phẩm này được pha loãng với nước và trộn với một thể tích tương đương của Emulphor 620P sao cho 1,0 ml chứa 25, 50 hoặc 100 μmol isothiocyanates (Bảng 1).

Tiến trình phát triển của khối u được theo dõi bằng cách sờ nắn vào các khoảng thời gian hàng tuần. Các phân tích Kaplan – Meier sau đó là so sánh thứ hạng nhật ký được sử dụng để kiểm tra sự khác biệt về tỷ lệ mắc khối u. Các con vật bị hoại tử ở 167 ngày tuổi, và các khối u tuyến vú được cắt bỏ, đếm và cân. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều tuân thủ Hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia và đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Johns Hopkins phê duyệt.

2. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

2.1. Chiết xuất và định lượng Glucosinolate và Isothiocyanates từ cây họ cải

Isothiocyanate Sulforaphane được phân lập từ chiết xuất acetonitril của các chất đồng nhất trong nước đông khô của bông cải xanh và được xác định là chất cảm ứng enzyme giai đoạn 2 chính và rất mạnh của loài cây họ cải này. Phát hiện này và sự chứng minh sau đó về hoạt động ngăn chặn khối u của sulforaphane đã tập trung sự chú ý của nhóm nghiên cứu vào tiềm năng của isothiocyanates có nguồn gốc thực vật như là chất bảo vệ hóa học và nhấn mạnh các đặc tính bảo vệ hóa học đã được công nhận từ lâu của nhóm hợp chất này. 

Tuy nhiên, hiện nay rõ ràng là Sulforaphane được phân lập phần lớn được lấy từ Glucosinolate (glucoraphanin) của nó thông qua hoạt động của myrosinase nội sinh trong quá trình phân lập. Glucosinolates per se không phải là chất cảm ứng nhưng được chuyển đổi định lượng bằng cách xử lý với myrosinase thành cognate isothiocyanates của chúng, là chất cảm ứng của các enzyme pha 2 (Hình 1 bên trái).

Cảm ứng quinone reductase trong tế bào u gan ở chuột Hepa 1c1c7 như một chức năng của nồng độ glucosinolate ( Trái ) và chiết xuất từ ​​bông cải xanh tươi trưởng thành ( Phải )

Hình 1: Cảm ứng quinone reductase trong tế bào u gan ở chuột Hepa 1c1c7 như một chức năng của nồng độ glucosinolate ( Trái ) và chiết xuất từ ​​bông cải xanh tươi trưởng thành ( Phải ). ( Trái ) Năm glucosinolate (GS). Đường cong: 1, glucoraphanin (glucosinolate của sulforaphane); 2, gluconapin (3-butenyl-GS); 3, sinigrin (allyl-GS); 4, progoitrin (2-hydroxy-3-butenyl-GS); 5, glucobrassicin (indol-3-ylmethyl-GS). Đường đặc, xử lý myrosinase; đường đứt nét, chưa được xử lý. ( Đúng) Một chiết xuất dung môi ba lần của bông cải xanh trưởng thành thu được từ một siêu thị địa phương. Hiệu lực cảm ứng được đo, trong trường hợp không có và có mặt myrosinase tinh khiết, trong các đĩa microtiter 96 giếng có chứa các dung dịch nước pha loãng nối tiếp của glucosinolate tinh khiết (được biểu thị bằng nồng độ micromolar) hoặc chiết xuất từ ​​bông cải xanh (được biểu thị bằng fr. Wt. Đương lượng tính bằng μg mỗi tốt). Lưu ý các thang đo nồng độ logarit. Từ giá trị CD là 30 μg fr. wt. tương đương với mỗi giếng, người ta có thể tính toán rằng mẫu bông cải xanh trưởng thành này chứa 33.300 đơn vị / g fr. wt. của hoạt động cảm ứng tiềm ẩn (so sánh với Hình 2).

Việc tìm kiếm các loại cây ăn được với mức độ hoạt tính cảm ứng cao đòi hỏi phải phát triển các phương pháp chiết xuất và định lượng hiệu quả (tốt nhất là trong cùng các chất chiết xuất) của isothiocyanates thường kỵ nước và glucosinolate hòa tan trong nước, trong các điều kiện ngăn cản quá trình thủy phân glucinolate bởi myrosinase. Người ta cũng mong muốn thu được các chất chiết xuất mà không sử dụng dung môi nóng để tránh mất các isothiocyanat dễ bay hơi và phản ứng cao và sử dụng các dung môi hòa tan trong nước có thể được thử nghiệm trực tiếp đối với hiệu lực cảm ứng QR và hàm lượng isothiocyanate bằng cách ngưng tụ cyclocondensation với 1 , 2-benzenedithiol.

Trong số một loạt các dung môi và kết hợp dung môi đã được khảo sát, một hỗn hợp có thể tích bằng nhau của dimethyl sulfoxit, dimethylformamide và acetonitril (dung môi ba) đặc biệt hiệu quả. Việc ngâm và đồng nhất nhanh chóng các mẫu thực vật tươi hoặc đông lạnh trong 10 thể tích dung môi ba ở -50°C, sau đó lọc hoặc ly tâm, tạo ra các chiết xuất hòa tan có chứa cả glucosinolate và isothiocyanates với năng suất cao. Chúng tôi đã so sánh các hoạt động cảm ứng của chất chiết xuất được xử lý bằng myrosinase của năm đầu bông cải xanh trưởng thành mới thu hoạch. Một số quy trình chiết xuất đã được sử dụng bao gồm nước lạnh, nước sôi, dung môi 80% metanol trong nước sôi, và dung môi ba, cũng như chiết xuất axetonitril của các chất đồng nhất trong nước đông khô. Dung môi ba và chiết xuất metanol 80% có hoạt tính cảm ứng rất cao (38.000–45.000 đơn vị / g fr. Wt.), trong khi chất chiết xuất từ ​​nước lạnh và nước sôi chỉ chứa khoảng 30% và chất chiết xuất từ ​​axetonitril chứa khoảng 10% hoạt tính này. Hơn nữa, chiết xuất ba dung môi cho thấy về cơ bản không có hoạt tính cảm ứng mà không được bổ sung myrosinase, bản thân nó không phải là chất cảm ứng (Hình.1 Đúng ), trong khi số lượng nhỏ hơn hoạt tính cảm ứng được chiết xuất bằng nước đã không tăng lên bằng cách xử lý myrosinase. Dung môi ba lạnh là một chất chiết xuất đơn giản, hiệu quả và có thể tái tạo cho cả glucosinolate và isothiocyanates, đồng thời cũng ngăn chặn hoạt động của myrosinase. Bằng cách sử dụng quy trình chiết xuất này, tiếp theo là bổ sung myrosinase tinh khiết, chúng tôi đã chỉ ra rằng gần như tất cả hoạt tính cảm ứng của các cây thuộc họ cải được đánh giá là có nguồn gốc từ glucosinolate.

2.2. So sánh hoạt động cảm ứng của rau giai đoạn trưởng thành tươi và đông lạnh

Bằng cách sử dụng dung môi ba để chiết xuất glucosinolate và chuyển đổi chúng thành isothiocyanates có hoạt tính sinh học của chúng với myrosinase, nghiên cứu đã so sánh các hoạt động cảm ứng enzyme giai đoạn 2 từ nhiều loại cây họ cải như arugula, bông cải xanh, cải Brussels, bắp cải, súp lơ, bắp cải Trung Quốc, collards, crambe, daikon , cải xoăn, su hào, mù tạt, củ cải đỏ, củ cải và cải xoong. Mặc dù nghiên cứu trước đó cho thấy ít hơn 3.400 đơn vị hoạt động cảm ứng trên mỗi g fr. wt của nhiều loại rau như vậy bao gồm cả bông cải xanh (được tính toán lại từ tham chiếu 11để cho phép khô / fr. wt. so sánh), chiết xuất với dung môi ba cung cấp từ 10.000 đến 100.000 đơn vị / g fr. wt. Phát hiện này về các hoạt tính cảm ứng cao hơn đáng kể là do việc chiết xuất chất cảm ứng và thủy phân glucosinolate hiệu quả hơn nhiều cách bổ sung myrosinase. 

Vì chất chiết xuất từ ​​bông cải xanh thường có tác dụng mạnh nhất, chúng tôi đã so sánh các hoạt động cảm ứng của 7 mẫu bông cải xanh đông lạnh (năm nhãn hiệu quốc gia) với 22 mẫu bông cải xanh tươi được thu thập ngẫu nhiên (giống không rõ nguồn gốc) thu được từ các siêu thị địa phương. Hoạt động của các mẫu đông lạnh dao động từ 9.000 đến 15.000 đơn vị / g fr. wt., trong khi các mẫu tươi có phạm vi hiệu lực gần gấp 8 lần từ 11.100 đến 83.300 đơn vị / g fr. wt. (trung bình = 35.100 đơn vị / g fr. wt; trung bình = 30.800 đơn vị / g fr. wt; (Hình 2). 

Hoạt động cảm ứng của các mẫu bông cải xanh tươi không liên quan đến hình dáng bên ngoài của chúng hoặc được trồng trong điều kiện thông thường hay hữu cơ. Trong tất cả 7 mẫu bông cải xanh đông lạnh và 21 trên 22 mẫu chiết xuất dung môi ba của bông cải xanh tươi trưởng thành, không có hoạt tính cảm ứng nào được phát hiện trước khi bổ sung myrosinase. Do đó, chúng tôi kết luận rằng sự đóng góp của các chất phytochemical khác ngoài glucosinolate vào hoạt tính cảm ứng của các chất chiết xuất này là không đáng kể. 

Các mẫu bông cải xanh đông lạnh nói chung có hiệu lực thấp hơn có thể do điều kiện bảo quản không thuận lợi hoặc do loại bỏ glucosinolate trong quá trình chần. Cả cây trồng và nhiều yếu tố môi trường đều có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng glucosinolate và do đó, tác động đến đến hiệu lực của chất cảm ứng.

Hoạt động cảm ứng quinone reductase của các mẫu bông cải xanh tươi và đông lạnh

Hình 2: Hoạt động cảm ứng quinone reductase của các mẫu bông cải xanh tươi và đông lạnh được lựa chọn ngẫu nhiên mua tại các siêu thị khu vực Baltimore. Những bông hoa của bảy lô bông cải xanh đông lạnh đại diện cho năm thương hiệu quốc gia (Hanover, America Choice, Green Giant, BirdsEye và BelAir) được chiết xuất bằng dung môi ba lạnh. Mỗi thanh đại diện cho phân tích một phần của từ 3 đến 5 lb được gộp chung. mẫu từ một lô duy nhất (1 lb. = 0,45 kg). Hiệu lực trung bình của các mẫu bông cải xanh đông lạnh là 12.000 đơn vị / g fr. wt. Hai mươi hai bó bông cải xanh tươi (từ một đến bốn con) được trồng thông thường và hữu cơ được lấy từ các siêu thị địa phương. Các bông hoa được đồng nhất trong dung môi ba lạnh và được xét nghiệm hoạt tính cảm ứng khi có thêm myrosinase tinh khiết. Hiệu lực trung bình là 35.000 đơn vị / g fr. wt.

2.3. Ảnh hưởng của tuổi thực vật đối với hiệu lực cảm ứng của các loại rau họ cải

Các thí nghiệm sơ bộ chỉ ra rằng hiệu lực cảm ứng (biểu thị cho mỗi g thực vật) chiết xuất của mầm non của arugula, bok choy, bông cải xanh, cải xanh, bắp cải, súp lơ, bắp cải, cress, daikon, kale, koohlrabi, mù tạt, củ cải, và cải xoong dao động từ 10 đến 100 lần so với những bông cải trưởng thành. 

Tương tự như vậy, trong mầm tám giống bông cải xanh, được trồng mà không có chất dinh dưỡng ngoại sinh, hoạt động cảm ứng (gần như tất cả đều phát sinh từ glucosinolates) trên mỗi đơn vị trọng lượng thực vật giảm một cách theo cấp số nhân từ mức tối đa trong hạt (Hình 3). Và tiếp tục giảm sau đó, tiếp cận các giá trị trong đầu bông cải xanh trưởng thành sau khoảng 15 ngày (dữ liệu không được hiển thị), trong khi tổng hoạt động cảm ứng trên mỗi cây không đổi. Các hoạt động cảm ứng đã giảm từ 1,8 triệu đơn vị / g hạt lên 180.000 chiếc / g Fr. wt. Lúc 9 ngày, phần lớn là do sự gia tăng trọng lượng thực vật từ hạt (3,3 mg) đến các mầm 9 ngày tuổi (60 mg). Rõ ràng không có tổng hợp ròng đáng kể của glucosinolate xảy ra trong các điều kiện này.

Ảnh hưởng của tuổi tác đến hiệu lực cảm ứng của chất chiết xuất từ ​​mầm bông cải xanh

Hình 3: Ảnh hưởng của tuổi tác đến hiệu lực cảm ứng của chất chiết xuất từ ​​mầm bông cải xanh. Mầm bông cải xanh được thu hoạch hàng ngày trong 9 ngày. Các chất chiết xuất được chuẩn bị bằng cách đồng nhất hóa trong dung môi ba lạnh và được thử nghiệm về hoạt tính của chất cảm ứng với myrosinase và ascorbate được thêm vào các đĩa giếng microtiter. Hiệu lực cảm ứng của mầm được biểu thị cả “trên mỗi mg trọng lượng cây tươi” ( Trên ) và “trên mỗi cây” ( Dưới ). Trọng lượng tươi trung bình được xác định trên các mẫu có ít nhất 20 mầm mỗi thời điểm. Trọng lượng hạt ban đầu khoảng 3,5 mg, và trọng lượng mầm tăng khoảng 6,6 mg / ngày. Các hoạt động cụ thể của cảm ứng của chất chiết xuất từ ​​mầm được xử lý myrosinase được so sánh với các hoạt động của hạt. Nếu không xử lý myrosinase, chất chiết xuất chứa <1,000 đơn vị / g fr. wt.

Khi các chất chiết xuất từ ​​mầm bông cải xanh được thử nghiệm với các tế bào ung thư gan đột biến có khiếm khuyết trong hoạt động của cytochrome P450, chúng hoàn toàn hoạt động như chất cảm ứng (dữ liệu không được hiển thị), chứng tỏ rằng chúng chứa chất cảm ứng đơn chức năng. Điều này được mong đợi vì hầu hết hoạt động cảm ứng của mầm phát sinh từ Sulforaphane, là chất cảm ứng đơn chức năng. Ngược lại, chất cảm ứng chức năng sinh học làm tăng cả enzyme pha 2 và một số enzyme pha 1 (cytochromes P450) thông qua cơ chế phụ thuộc vào thụ thể hydrocacbon aryl.

Trong khi hoạt tính cảm ứng cao đối với mầm của tất cả các loài cây họ cải được kiểm tra, thì hoạt tính này luôn cao nhất đối với các giống súp lơ xanh và súp lơ. Mầm ba ngày tuổi của các cây trồng thương mại ngẫu nhiên của bông cải xanh (n = 26) và súp lơ trắng (n = 28) tạo ra hiệu lực cảm ứng từ 92.500 đến 769.000 đơn vị / g fr. wt. (trung bình = 293.000 đơn vị / g fr. wt.) và từ 50.000 đến 560.000 đơn vị / g fr. wt. (trung bình = 251.000 đơn vị / g fr. wt.), tương ứng. Thu hoạch lặp đi lặp lại quy mô kg đối với mầm bông cải xanh (giống SAGA) 3 ngày tuổi cho năng suất trung bình là 511.000 đơn vị / g fr. wt. ( n = 14).

2.4. Cấu hình glucosinolate của mầm và bông cải xanh trưởng thành

Sự khác biệt đáng kể về số lượng giữa hiệu lực cảm ứng của mầm non và cây cải trưởng thành được trồng từ cùng một lô hạt giống có liên quan đến sự khác biệt về chất lượng và định lượng nổi bật như nhau trong cấu hình glucosinolate của những cây này. Sắc ký ion đôi xác nhận rằng các glucosinolate chính trong bông cải xanh trưởng thành thường là indol: glucobrassicin, neoglucobrassicin và số lượng nhỏ hơn 4-hydroxyglucobrassicin (ví dụ Hình 4). 

Mặc dù thành phần indole glucosinolate khác nhau đáng kể giữa các giống cây trồng và thậm chí giữa các mẫu khác nhau của cùng một giống cây trồng, nhưng trung bình, indole glucosinolate chiếm 67% tổng số glucosinolate trong các chiết xuất được chuẩn bị từ 7 giống súp lơ xanh (DeCicco, Emperor, Everest, Excelsior, Green Comet, Green Valiant, và SAGA). 

Ngược lại, ở hầu hết các mầm và hạt giống bông cải xanh và súp lơ 3 ngày tuổi (> 70 cây trồng được kiểm tra), dưới 10% tổng số glucosinolate là indol, và ở nhiều cây trồng không thể phát hiện được (Hình 4). Những mầm này chủ yếu chứa alkylthioglucosinolate: điển hình là glucoraphanin với số lượng nhỏ hơn glucoerucin và glucoiberin (3-methylsulfinylpropyl glucosinolate). 

Tổng hàm lượng glucosinolate lần lượt là 22,7 và 3,37 μmol / g fr. wt. đối với mầm và bông cải xanh trưởng thành. Tuy nhiên, indole glucosinolate chỉ chiếm 3% trong tổng số glucosinolate trong những mầm này, so với 68% của những glucosinolate trong cây trưởng thành. Có gấp 20 lần methylsulfinylalkyl glucosinolate (glucoraphanin và glucoerucin) trong mầm so với bông cải xanh trưởng thành. Do đó, một khẩu phần 100 g bông cải xanh trưởng thành sẽ cung cấp 108 μmol methylsulfinylalkyl glucosinolate và 229 μmol indole glucosinolate.

So sánh hồ sơ glucosinolate HPLC của mầm bông cải xanh 2 ngày tuổi

Hình 4: So sánh hồ sơ glucosinolate HPLC của mầm bông cải xanh 2 ngày tuổi với các bông hoa từ đầu của bông cải xanh trưởng thành được trồng từ cùng hạt giống của giống cây trồng SAGA. Tất cả các mẫu được chiết bằng dung môi ba và các glucosinolate thành phần được phân giải bằng sắc ký ion cặp ( 18 ). Chất chiết xuất tương đương với 62,4 mg fr. wt. của bông cải xanh trưởng thành và 9,45 mg fr. wt của mầm đã được phân tích. Glucosinolate được xác định bằng cách phân tích lại sau khi điều trị bằng myrosinase; các đỉnh màu đen bóng mờ đã biến mất khi xử lý như vậy. Các glucosinolate như sau. Đỉnh: A, glucoraphanin; B, 4-hydroxyglucobrassicin; C, glucoerucin; D, glucobrassicin; E, neoglucobrassicin. Đặc điểm hóa học của các pic A, C, D và E đã được xác nhận bằng phương pháp khối phổ và NMR ( 18). Trong chiết xuất từ ​​mầm, các đỉnh chính là glucoraphanin (16,6 μmol / g fr.) Và glucoerucin (5,41 μmol / g fr. Wt.), Và chỉ 0,71 μmol / g fr. wt. của 4-hydroxyglucobrassicin. Chiết xuất bông cải xanh trưởng thành chứa glucoraphanin (1,08 μmol / g fr. Wt.) Và indoles glucobrassicin (1,67 μmol / g fr. Wt) và neoglucobrassicin (0,62 μmol / g fr. Wt.).

Những khác biệt này trong cấu hình glucosinolate giữa mầm non và bông cải xanh trưởng thành là mối quan tâm đáng kể và có tầm quan trọng tiềm tàng trong việc đề ra các chiến lược bảo vệ hóa học ở người. Các methylsulfinylalkyl glucosinolate chứa ở nồng độ cao trong rau mầm là chất cảm ứng đơn chức năng. 

Hơn nữa, Sulforaphane dường như không gây độc gen đáng kể ở chỗ nó không kích thích sự tổng hợp DNA không theo lịch trình trong tế bào gan cũng như sự hình thành các chất hoàn nguyên histidine trong xét nghiệm Salmonella typhimurium. Ngược lại, sự thủy phân indole glucosinolate bởi myrosinase làm phát sinh các chất cảm ứng chức năng, chẳng hạn như indole-3-carbinol và indole-3-nitrile, và các sản phẩm ngưng tụ, chẳng hạn như 3,3′-diindolylmethane và indole-3-carbazole, liên kết với thụ thể aryl hydrocacbon. 

Indole-3-carbinol vừa là chất chống lại ung thư vừa là chất tăng cường sự hình thành khối u ở động vật, tùy thuộc vào hệ thống thí nghiệm và thời điểm sử dụng liên quan đến việc tiếp xúc với chất gây ung thư. Do đó, có những hạn chế tiềm tàng đối với việc sử dụng indole glucosinolate làm chất bảo vệ hóa học ở người vì chúng:

2.5. Ức chế sự phát triển khối u tuyến vú do DMBA kích thích ở chuột bằng chiết xuất từ ​​mầm bông cải xanh

Sulforaphane và một số chất tương tự acetylnorbornyl isothiocyanate tổng hợp, là chất cảm ứng enzym mạnh pha 2, làm giảm tỷ lệ mắc, tính đa dạng và trọng lượng của khối u tuyến vú và làm chậm sự phát triển khối u ở chuột Sprague – Dawley cái được điều trị bằng một liều DMBA. Do đó, chúng tôi lý luận rằng chất chiết xuất từ ​​mầm cây họ cải có chứa hàm lượng glucoraphanin cao và hoạt tính cảm ứng cao có liên quan nên cũng có hoạt tính chống khối u. 

Theo đó, chiết xuất từ ​​nước sôi của mầm bông cải xanh 3 ngày tuổi giàu glucoraphanin được đánh giá là chất ức chế hệ thống khối u tuyến vú của chuột DMBA. Mặc dù dung môi ba là một dung môi hiệu quả hơn, nó không được sử dụng để sản xuất các chế phẩm này vì dư lượng dung môi có thể làm xáo trộn việc giải thích các thí nghiệm cho ăn. 

Vì hoạt động cảm ứng của chất chiết xuất từ ​​mầm bông cải xanh 3 ngày tuổi gần như chỉ có nguồn gốc từ hai glucosinolate (thường là khoảng 75% glucoraphanin và 25% glucoerucin), nghiên cứu đã kiểm tra các chất chiết xuất trước và sau khi điều trị myrosinase để xác định tác dụng của glucosinolate và isothiocyanates trong ức chế khối u. Các chế phẩm mầm này đã được chuẩn hóa theo hoạt động cảm ứng của chúng trong xét nghiệm tế bào u gan ở chuột, bằng cách giả định gần đúng rằng toàn bộ hoạt tính cảm ứng có nguồn gốc từ glucoraphanin hoặc sulforaphane. Liều hàng ngày của glucosinolate (25 và 100 μmol) và isothiocyanates (25, 50 và 100 μmol) được sử dụng vào các ngày 47–51 cho nhóm 20 con chuột cũng nhận được 10 mg DMBA ở 50 ngày tuổi, 2 giờ sau khi dùng chiết xuất từ ​​mầm, theo một quy trình tiêu chuẩn.

Sự phát triển của khối u tuyến vú, được theo dõi bằng cách sờ nắn vào các khoảng thời gian hàng tuần, bị chậm lại đáng kể so với đối chứng, liên quan đến tính đa dạng của khối u (khối u trên mỗi con vật) và tỷ lệ mắc bệnh (phần nhỏ số động vật mang khối u) (Hình 5 ). Tỷ lệ khối u ở tất cả các liều điều trị glucosinolate và isothiocyanate thấp hơn so với đối chứng ( P= 0,0197 và 0,0190 tương ứng). 

Nghiên cứu kết thúc phân tích sự tiến triển của khối u bằng cách sờ nắn vào lúc 147 ngày tuổi. Sự chậm phát triển của khối u rõ ràng phụ thuộc vào liều lượng của isothiocyanates, nhưng hiệu lực của liều 25 μmol của glucosinolate dường như tương tự như liều 100 μmol, cho thấy rằng liều thấp hơn có thể tạo ra hiệu quả gần như tối đa. Tất cả các phương pháp điều trị đều làm giảm rõ rệt tổng số khối u được tìm thấy khi mổ hoại tử. Có 34 khối u trong nhóm đối chứng (20 động vật sống sót) và 11–19 khối u trong nhóm được điều trị (19–20 động vật sống sót).

Ảnh hưởng của chiết xuất từ ​​nước nóng của mầm bông cải xanh 3 ngày tuổi đối với sự phát triển khối u tuyến vú

Hình 5: Ảnh hưởng của chiết xuất từ ​​nước nóng của mầm bông cải xanh 3 ngày tuổi đối với sự phát triển khối u tuyến vú ở chuột cái Sprague – Dawley được điều trị bằng DMBA. Thành phần phân tích của chất chiết xuất glucosinolate và isothiocyanate được đưa ra trong Bảng 1 . Các con vật được kiểm tra các khối u cách nhau hàng tuần. ( Phía trên ) Tỷ lệ mắc khối u (phần trăm chuột có khối u). ( Thấp hơn ) Tính đa dạng của khối u (số lượng khối u / số lượng chuột có nguy cơ mắc bệnh). Tiến trình phát triển khối u trong nhóm đối chứng duy nhất được hiển thị trong tất cả các bảng. Các con vật nhận được liều hàng ngày trong dạ dày là 25 hoặc 100 μmol glucosinolate ( Trái ) và 25, 50 hoặc 100 μmol isothiocyanates ( Phải) ở tuổi 47–51 ngày. Các liều 25 μmol tương ứng với 81 và 106 mg chiết xuất đông khô cho các chế phẩm glucosinolate và isothiocyanate, tương ứng. Ý nghĩa thống kê của sự chậm phát triển khối u (tỷ lệ mắc bệnh) so với nhóm chứng như sau. Đối với liều glucosinolate 25 và 100 μmol, P = 0,0079 và 0,138 tương ứng. Đối với liều isothiocyanates 25, 50 và 100 μmol, P = 0,214, 0,0422 và 0,0058 tương ứng.

Tác dụng ức chế khối u của chiết xuất từ ​​mầm trong các thí nghiệm này có thể so sánh với tác dụng quan sát được với 75 μmol sulforaphane tổng hợp trong một quy trình tương tự. Do đó, có vẻ như mầm bông cải xanh không chứa chất bảo vệ hóa học mạnh đáng kể ngoài glucosinolate / isothiocyanates được xác định trong các nghiên cứu này. Mặc dù tác dụng bảo vệ hóa học của isothiocyanates đã được công nhận rõ ràng. 

Các thí nghiệm chống khối u duy nhất với glucosinolate là của Wattenberg và cộng sự người đã báo cáo rằng liều lượng tương đối lớn của benzyl glucosinolate (147 μmol) và glucobrassicin (134 μmol) làm giảm đáng kể sự hình thành khối u tuyến vú ở chuột được điều trị bằng DMBA. Tác dụng bảo vệ hóa học của glucosinolate có thể không phụ thuộc vào quá trình thủy phân thành isothiocyanates và cần được xem xét thêm.

Hiệu quả cao của chiết xuất nước nóng đông khô của mầm bông cải xanh trong việc ngăn chặn sự phát triển của khối u ở tuyến vú, trái ngược hẳn với một vài nghiên cứu trước đây về tác dụng ức chế khối u của việc cho các loài gặm nhấm ăn những cây họ cải trưởng thành đã phơi khô. Trong nghiên cứu hiện tại (Hình 5) việc sử dụng hàng ngày chiết xuất từ ​​mầm khô dao động từ 81 đến 424 mg (tức là 0,54 đến 2,83% của lượng thức ăn ước tính 15 g hàng ngày) cung cấp một tác dụng ức chế khối u rất đáng kể. Ngược lại, 5–40% cây họ cải trưởng thành được sấy khô trong chế độ ăn uống là bắt buộc để đạt được sự bảo vệ.

3. Kết luận

Một lượng lớn chất cảm ứng của các enzyme bảo vệ có tác dụng chống lại ung thư có thể được cung cấp trong chế độ ăn uống bởi một lượng nhỏ mầm cây họ cải non (ví dụ, mầm bông cải xanh 3 ngày tuổi) có chứa hoạt tính cảm ứng nhiều gấp 10–100 lần số lượng rau trưởng thành. Hơn nữa, hoạt tính cảm ứng chủ yếu phát sinh từ glucoraphanin (glucosinolate của sulforaphane) và những mầm như vậy chứa số lượng tương đối thấp glucosinolate indole – chất kích thích khối u tiềm năng. Bởi vì ít người biết đến quá trình chuyển hóa glucosinolate ở người, nghiên cứu đã được tiến hành (được xuất bản riêng) để chứng minh quá trình chuyển đổi hiệu quả glucosinolate thành isothiocyanates ở người khi không có myrosinase thực vật.

4. Các chủ đề liên quan

Dưới đây là một số bài viết về các chủ đề nghiên cứu có liên quan đến hoạt chất Sulforaphane và công dụng của chúng:

5. Tham vấn chuyên môn

 

Exit mobile version