Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Ban biên tập Admin SulLab
Biên tập và tổng hợp

Sullab Admin

Mục lục

Thông tin nghiên cứu 

Từ khóa:

  • Virus corona
  • COVID-19
  • MERS CoV
  • Vắc xin dựa trên epitope
  • Màn hình phage kết hợp
  • Hoàn nguyên Epitope

Tổng quan 

Vào đầu những năm 1960, coronavirus đầu tiên xuất hiện đối với con người (được chỉ định là 229E và OC43) được xác định là tác nhân gây bệnh của cảm lạnh thông thường. Sau đó là sự cách ly của ba corona virus trên người khác có liên quan tương tự với các bệnh giống như cảm lạnh. Trái ngược với những coronavirus “nhẹ” này, trong 20 năm qua, đã có ba sự kiện độc lập về sự xuất hiện của đại dịch bệnh hô hấp cấp tính và nghiêm trọng đe dọa tính mạng do ba loại virus beta-coronavirus mới, SARS CoV, MERS CoV và gần đây nhất là SARS CoV2. 

Trong khi SARS CoV đầu tiên xuất hiện vào tháng 11 năm 2002 và tự nhiên biến mất vào mùa hè năm 2003, thì MERS CoV vẫn tiếp tục lây lan sang người thông qua vật trung gian là lạc đà, gây ra hàng chục trường hợp hàng năm. Mặc dù lây truyền từ người sang người là rất hiếm, nhưng tỷ lệ tử vong của bệnh MERS CoV cao hơn đáng kể hơn 30%. Tuy nhiên, COVID-19 ít gây tử vong hơn nhiều, mặc dù tác nhân gây bệnh của nó, SARS CoV2, có khả năng lây nhiễm rất cao, đặc biệt là với sự phát triển gần đây của các biến thể Omicron đang được quan tâm (BA.1 và BA.2). Đáng lưu ý, tỷ lệ mắc MERS CoV trong quần thể lạc đà ở Châu Phi và Trung Đông là rất cao. Hơn nữa, MERS CoV và SARS CoV2 cùng tồn tại ở Trung Đông và đặc biệt là ở Ả Rập Xê-út và UAE, nơi các tỷ lệ đồng nhiễm lẻ tẻ đã được báo cáo. Đồng nhiễm, do sự lan truyền ngược của SARS CoV2 sang lạc đà hoặc ở người bị nhiễm kép có thể dẫn đến sự tái tổ hợp giữa hai loại virus, khiến SARS CoV2 gây chết người nhiều hơn hoặc MERS CoV dễ lây truyền hơn. 

Trong nỗ lực chuẩn bị cho những gì có thể phát triển thành một sự kiện thảm khốc, chúng tôi đã tập trung vào việc phát triển một chất sinh miễn dịch mới dựa trên epitope cho MERS CoV. Việc triển khai các thư viện tuân thủ sự hiển thị tổ hợp phage, Motif liên kết thụ thể (RBM) của protein MERS CoV Spike đã được hoàn nguyên thành công và được công nhận bởi một bảng gồm bảy kháng thể đơn dòng trung hòa.

Giới thiệu về nghiên cứu

Vào ngày 16 tháng 11 năm 2002, một người đàn ông 64 tuổi ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc đã chết vì một căn bệnh đường hô hấp không rõ nguyên nhân (Peiris và cộng sự, 2004; Rota và cộng sự, 2003). Ông còn được biết đến với cái tên “Bệnh nhân Zero” – là trường hợp đầu tiên trong số ba đợt bùng phát beta-coronavirus trong 20 năm qua. Hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng (SARS) là do vi rút coronavirus (SARS CoV) chưa từng biết trước đây gây ra (Rota và cộng sự, 2003). Nơi chứa virus tự nhiên là dơi (Hu và cộng sự, 2017); tuy nhiên, một vector trung gian cũng đã được xác định – cầy hương (Wang và cộng sự, 2006). Những kẻ săn mồi này thường xuyên tập trung vào các thị trường thực phẩm và vì vậy, trong nỗ lực hạn chế sự lây lan của dịch bệnh, 10.000 con cầy hương đã bị tiêu diệt trong một chiến dịch tiêu hủy lớn (Parry, 2004). Đến tháng 7 năm 2003, 8096 trường hợp SARS CoV đã được báo cáo ở 37 quốc gia với tỷ lệ tử vong là 9,6%. Không có trường hợp nhiễm SARS CoV mới nào được báo cáo kể từ năm 2004 (Low, 2004; Stockman và cộng sự, 2006). 

Một đợt bùng phát coronavirus thứ hai xảy ra vào năm 2012, ở bán đảo Ả Rập Xê Út dẫn đến Hội chứng Hô hấp Trung Đông (MERS) do MERS CoV gây ra (Al-Abdallat và cộng sự, 2014; Killerby và cộng sự, 2020; Zaki và cộng sự, 2012 ). Tương tự như đại dịch SARS, MERS CoV dường như truyền từ dơi sang vật trung gian, lần này là lạc đà vảy và từ lạc đà lây sang người (Durai và cộng sự, 2015). Cập nhật mới nhất từ ​​Trung tâm Phòng ngừa và Kiểm soát Dịch bệnh Châu Âu (ECDC) về mối đe dọa MERS CoV (ngày 31 tháng 12 năm 2021) là tổng số 2600 trường hợp ở 27 quốc gia đã được báo cáo với 943 trường hợp tử vong (tỷ lệ tử vong là 36%) ( ECDC, 2022). 

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Kể từ khi MERS CoV xuất hiện, hàng năm đã có nhiều trường hợp mắc và tử vong được báo cáo, chủ yếu đến từ Bán đảo Ả Rập Xê Út, Bảng 1 (FAO, 2022; Robert Carlson, 2021). Đáng chú ý là một đợt bùng phát tập trung, riêng lẻ nhưng nghiêm trọng xảy ra vào năm 2015 ở Hàn Quốc, nơi phát hiện 185 trường hợp (và một trường hợp nữa ở Trung Quốc) dẫn đến 38 trường hợp tử vong (WHO, 2021). Hơn 16.900 người tiếp xúc gần gũi đã được cách ly trong hai tuần để chứa vi rút và kể từ đó dịch bệnh ở Hàn Quốc dường như đã được kiểm soát (Oh et al., 2018). Kể từ tháng 1 năm 2021, 19 trường hợp MERS CoV mới đã được báo cáo, trong đó 8 bệnh nhân tử vong (ECDC, 2022). 

Bảng 1 . Các trường hợp MERS CoV ở người theo quốc gia và ngày tháng. Dữ liệu được lấy từ Bộ Nông nghiệp và Chăn nuôi, Bộ Y tế; Trung tâm Phòng chống và Kiểm soát Dịch bệnh (CDC) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Thú y Thế giới (OIE).

18 tháng 8 năm 2021 Quốc gia Nhiễm MERS-CoV ở người Quan sát đầu tiên Lần quan sát cuối cùng Covid-19 vào ngày 02/05/22
Trung Đông Ả Rập Saudi 2184 13/06/2012 29/12/2021 708.650
các Tiểu Vương Quốc Ả Rập Thống Nhất 93 19/03/2013 06/11/2021 857.633
Jordan 28 02/04/2012 26/09/2015 1326,993
Qatar 23 15/08/2013 18/02/2020 349.027
Oman 24 26/10/2013 20/02/2019 351.641
Iran (Cộng hòa Hồi giáo) 6 11/05/2014 18/03/2015 6566,967
Kuwait 4 30/10/2013 08/09/2015 579.032
Lebanon 2 22/04/2014 08/06/2017 974.099
Yemen 1 17/03/2014 17/03/2014 11.167
Bahrain (Vương quốc của) 1 04/04/2016 04/04/2016 420.806
Châu Á Hàn Quốc 185 11/05/2015 28/08/2018 1007.380
Phi-líp-pin 2 15/04/2014 30/06/2015 3608.632
nước Thái Lan 3 10/06/2015 25/07/2016 2496.612
Trung Quốc 1 21/05/2015 21/05/2015 106.324
Malaysia 2 08/04/2014 24/12/2017 2913.248
Châu Âu Vương quốc Anh 5 03/09/2012 16/08/2018 17.810.577
nước Đức 3 05/10/2012 07/03/2015 11.112.069
nước Hà Lan 2 01/05/2014 05/05/2014 4837.279
Nước pháp 2 23/04/2013 27/04/2013 20,735,309
Áo 2 22/09/2014 08/09/2016 2059.862
gà tây 1 25/09/2014 25/09/2014 12.249.282
Nước Ý 1 25/05/2013 25/05/2013 11.635.950
Hy Lạp 1 08/04/2014 08/04/2014 2052.892
Châu Mỹ nước Mỹ 2 14/04/2014 01/05/2014 78.071.713
Châu Phi Tunisia 3 01/05/2013 17/06/2013 945.734
Algeria 2 23/05/2014 23/05/2014 258.390
Ai cập 1 22/04/2014 22/04/2014 493.648

Mặc dù MERS CoV gây ra một bệnh hô hấp rất nặng với tỷ lệ tử vong rất cao, sự lây truyền từ người sang người của vi rút này, qua các giọt nhỏ, chỉ giới hạn ở những người tiếp xúc rất gần, chủ yếu ở bệnh viện – nơi bệnh nhân. Do đó, tổng thể đại dịch phản ánh nhiều sự kiện lây lan từ động vật sang người hơn là sự lây truyền từ người sang người ( Berruga-Fernández et al., 2021 ; A.-R. Zhang et al., 2021 ). May mắn thay, cho đến nay, vi rút dường như vẫn chưa thích nghi để lây truyền sang người một cách hiệu quả.

Trái ngược hoàn toàn với MERS CoV, vào tháng 12 năm 2019, một sự kiện đại dịch thứ ba đã xuất hiện ở Vũ Hán, Trung Quốc với sự xuất hiện của một loại virus betacoronavirus mới, SARS CoV2 (Zhou và cộng sự, 2020). Một lần nữa, vi rút dường như bắt nguồn từ dơi, truyền sang người qua vật trung gian có thể là tê tê (Y. Zhang và cộng sự, 2021). Tuy nhiên, ngược lại rõ rệt với hai đợt bùng phát trước, SARS CoV2 đã phát triển nhanh chóng để trở thành một loại vi rút cực kỳ dễ lây lan, thích ứng với con người trong nhiều đợt lây nhiễm, mỗi đợt lại xuất hiện các biến thể mới đáng lo ngại (Chan và cộng sự, 2020 ; Li và cộng sự, 2021; Salleh và cộng sự, 2021; Volz và cộng sự, 2021). Cho đến nay (tháng 2 năm 2022) hơn 390 triệu người trên toàn thế giới đã bị nhiễm SARS CoV2, giết chết hơn 5,7 triệu người sau khi nhiễm bệnh (tỷ lệ tử vong khoảng 1,5%). Do đó, các chiến dịch tiêm chủng chưa từng có đã được thúc đẩy trên toàn cầu trong nỗ lực kiềm chế đại dịch và kiểm soát SARS CoV2. SARS CoV2 được đánh giá là một tiềm năng nghiêm trọng của coronavirus để thích nghi và dần dần cải thiện khả năng lây truyền từ người sang người của chúng. Rõ ràng, tất cả các nỗ lực để ngăn chặn sự lây truyền mạnh mẽ như vậy đối với MERS CoV và để chống lại sự tiến hóa của virus cần được thực hiện (Du et al., 2016; A.-R. Zhang et al., 2021). Điều đáng lo ngại không kém là thực tế rằng đồng nhiễm của cả hai loại virus đã được báo cáo (Al-Abdallat và cộng sự, 2014; Baddal và Cakir, 2020; Lai và cộng sự, 2020). Những tình huống như vậy có thể dẫn đến tái tổ hợp di truyền (FAO, 2021; Funk và cộng sự, 2016; Hu và cộng sự, 2017; Kiambi và cộng sự, 2018; Li và cộng sự, 2020; Peiris và Perlman, 2022; So và cộng sự ., 2019; Su và cộng sự, 2016; Te và cộng sự, 2021; Teng và cộng sự, 2021; Xiong và cộng sự, 2022; Zhang và cộng sự, 2019, 2005), tạo ra các dòng MERS CoV mới phân lập được cải thiện khả năng lây truyền (Baddal và Cakir, 2020; Elhazmi et al., 2021; Funk et al., 2016; Kiambi et al., 2018; Su et al., 2016; Te et al., 2021; Xiong et al., 2022; Zhang và cộng sự, 2019) hoặc tạo ra các phiên bản SARS CoV2 gây chết người cao hơn rõ rệt (Chen và cộng sự, 2021; Dimonaco và cộng sự, 2020; Safari và Elahi, 2021). Về vấn đề này, cần lưu ý rằng tỷ lệ lưu hành MERS CoV trong quần thể lạc đà ở Châu Phi và Trung Đông là rất cao (Ababneh và cộng sự, 2021; Al-Tawfiq và Memish, 2020; Funk và cộng sự, 2016; Te và cộng sự, 2021; Zhang và cộng sự, 2019). Hơn nữa, đã có nhiều báo cáo về khả năng SARS CoV2 lây lan trở lại thành công vào nhiều loại động vật có vú bao gồm chó, mèo, hổ, chồn và chồn (Banerjee và cộng sự, 2021; Hobbs và Reid, 2021; Oude Munnink và cộng sự, 2021; Schlottau và cộng sự, 2020; Sharun và cộng sự, 2021; Shi và cộng sự, 2020; Starr và cộng sự, 2022). Có vẻ như nó chỉ là một vấn đề thời gian mà SARS CoV2 cũng có thể lây nhiễm cho lạc đà. Điều này đặc biệt đáng lo ngại đối với các quốc gia như Ả Rập Xê-út và UAE với hơn 700.000 và 850.000 trường hợp được báo cáo về SARS CoV2, hai quốc gia có số lượng lớn lạc đà bị nhiễm MERS CoV. Với ý nghĩ này, ở đây chúng tôi mô tả sự phục hồi chức năng của Motif gắn kết thụ thể MERS CoV (RBM), là biểu mô trung hòa chính của beta-coronavirus và do đó có thể cung cấp chất sinh miễn dịch hiệu quả để phát triển vắc xin dựa trên biểu mô MERS CoV, được cân nhắc một cách như nhau đối với con người và lạc đà.

Nguyên liệu và phương pháp

Phát triển hệ thống vectơ

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Vectơ fth1 được phát triển tại Đại học Tel Aviv như đã được mô tả trước đây (Enshell-Seijffers và cộng sự, 2001) và sau đó được sửa đổi để biểu hiện các peptit tái tổ hợp dưới dạng dung hợp tại đầu tận cùng N của protein gây nhiễm, P3, của xạ khuẩn dạng sợi fd (Smelyanski và Gershoni, 2011). Hệ thống vectơ pMALc được cung cấp bởi N. T. Freund, Đại học Tel Aviv. Vectơ pET30a-N6xHis-GST được điều chỉnh từ pET-30a thương mại (Novagen, Sigma-Aldrich; 69909, Hoa Kỳ) bởi G. Kaplan, Đại học Tel Aviv.

Thu thập các kháng thể và cơ quan thụ cảm 

Bảy mAbs trung hòa nhắm vào mục tiêu MERS CoV RBM đã được sử dụng trong nghiên cứu này: mAbs m-336, m-337, m-338 của con người được cung cấp bởi D. S. Dimitrov và T. Ying. MAb CDC-C2 của người, chuột mAbs F- 11 và C-12 và khỉ rhesus mAb JC57–11 được cung cấp bởi BS Graham (xem Lingshu và cộng sự, 2021; Wang và cộng sự, 2015; Ying và cộng sự, 2014). Protein tái tổ hợp CD26 của người (Fc-chimera) được mua từ Abcam (ab 155730), Zotal, Israel. Huyết thanh đa dòng kháng M13 của thỏ được sản xuất tại Phòng thí nghiệm Gershoni tại Đại học Tel Aviv. Các kháng thể liên hợp với HRP được mua từ Phòng thí nghiệm Jackson ImmunoResearch, Inc (West Grove, PA, Hoa Kỳ).

Xây dựng các thư viện tuân thủ của MERS CoV RBM 

Việc khôi phục SARS CoV RBM đã được mô tả trước đây (Freund và cộng sự, 2015) và là cơ sở để hoàn nguyên MERS CoV RBM. Về nguyên tắc, các phân đoạn của MERS CoV RBM tự nhiên được kết nối thông qua các trình liên kết tổ hợp, do đó tạo ra sự đa dạng của các bộ định tuyến. Theo quan điểm của thực tế là MERS CoV RBM lớn hơn của SARS CoV, các thư viện đã được biểu thị và hiển thị trên Protein, P3 của vi khuẩn dạng sợi fd (5 bản sao trên mỗi phage). Do đó, các thư viện phù hợp hiển thị phage tổ hợp cụ thể của virus đã được tạo ra. Vì vậy, vectơ fth1 đã sửa đổi (Smelyanski và Gershoni, 2011), đã được sử dụng để xây dựng các thư viện bộ tuân thủ MERS CoV RBM. 

Cụ thể, một gBlock gồm các trình tự DNA sợi kép tương ứng với MERS CoV RBM (K493 – E565, “RBM có chiều dài đầy đủ”) (Raj và cộng sự, 2013), chứa các trình tự chồng chéo thứ f thứ1 BstXI ở cả hai đầu 5 ‘và 3’ là được mua từ Công nghệ DNA tích hợp (IDT, Israel). Sau đó, nó được sử dụng làm khuôn mẫu PCR để tạo ra hai phân đoạn tương ứng với: 

  • Phân đoạn A: gốc axit amin K493-P515 của MERS CoV RBM, theo sau là một loạt trình tự liên kết của 3, 4, 5, 6 và 7 axit amin ngẫu nhiên trong chiều dài (sử dụng sense Primer # 1 được ghép nối với antisense Primer # 3–7) hoặc không có liên kết nào cả (antisense Primer # 2). 
  • Phân đoạn B: dư lượng C526-E565 của MERS CoV RBM (sử dụng Primer cảm giác # 8 và Antisense Primer # 9), dư lượng cysteine ​​526 được giữ lại như một phần của RBM để duy trì disulfide C526-C503 ổn định RBM. 

Mồi: (lưu ý, Mồi # 3–7 là antisense và do đó chứa codon antisense “MNN” bổ sung cho codon cảm giác NNK): 

  • 1: 5’CCTTTCTATTCTCACTCCGCTC 3 ’. 
  • 2: 5’GGATGGGACAATGGATACACAAGGTACTTCAGTAACGATCAT CAGA 3 ’. 
  • 3: 5’GGATGGGACAATGGATACACAMNNMNNMNNAGGTACTTCAG TACGATCATCAGA 3 ’. 
  • 4: 5’GGATGGGACAATGGATACACAMNNMNNMNNMNNAGGTACT TCAGTACGATCATCAGA 3 ’. 
  • 5: 5’GGATGGGACAATGGATACACAMNNMNNMNNMNNMNNAGG TACTTCAGTACGATCATCAGA 3 ’. 
  • 6: 5’GGATGGGACAATGGATACACAMNNMNNMNNMNNMNNMNN AGGTACTTCAGTACGATCATCAGA 3 ’. 
  • 7: 5’GGATGGGACAATGGATACACAMNNMNNMNNMNNMNNMNN MNNAGGTACTTCAGTACGATCATCAGA 3 ’. 
  • 8: 5’TGTGTATCCATTGTCCCATCC 3 ’. 
  • 9: 5’CTTTCAACAGTTTCCCAGACG 3 ’. 

Tất cả các sản phẩm PCR được tinh chế bằng cách sử dụng hạt AMPure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) và được nhân bản thành vectơ cắt trước BstXI bằng phản ứng lắp ráp Gibson (Gibson và cộng sự, 2010). Do đó, các cấu trúc sau đây đã được tạo ra: 

  • RBM “Độ dài đầy đủ” (FL), phần dư 493–565 bao gồm “vòng neo” (phần dư Q516-P525); 
  • RBM “không có vòng lặp” (LL) trong đó các gốc P515 và C526 được kết nối trực tiếp với nhau, không có axit amin nào thay cho vòng bị xóa; 
  • Bộ định tuyến ngẫu nhiên RBM chứa bất kỳ một trong 5 trình liên kết ngẫu nhiên (3, 4, 5, 6 và 7 axit amin), thay cho “vòng neo” đã bị xóa. 

Các sản phẩm phản ứng Gibson được tinh chế bằng etanol được sử dụng để kết hợp các tế bào có thẩm quyền điện của E. coli ER2738 (cat. Số 60522–1, Lucigen, Middleton, WI, USA) và các dòng vô tính đã được phân lập và xác nhận trình tự chính xác bằng cách giải trình tự chuẩn của Sanger. Vi khuẩn được nuôi cấy (lắc ở 225 vòng / phút, 37 oC, qua đêm) và phage được kết tủa từ môi trường nuôi cấy bằng cách sử dụng polyetylen glycol 6000 / NaCl và được tiếp tục trong dung dịch muối đệm Tris (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl (TBS)).

Sàng lọc các thư viện tuân thủ

Các thư viện đã được sàng lọc để chống lại MERS CoV trung hòa mAbs. Các mAbs sau đã được sử dụng (Wang và cộng sự, 2018; Xu và cộng sự, 2019; Ying và cộng sự, 2014; Zhang và cộng sự, 2018): 

  • mAbs trung hòa của con người m-336, m-337, m-338 và CDC-C2; 
  • khỉ đuôi dài mAb JC57–11; 
  • murine mAbs F-11 và C-12.

Nói chung, việc sàng lọc đã được thực hiện như đã mô tả trước đây. Một cách ngắn gọn, 2 μg mAb được thêm vào 1011 phage lơ lửng trong albumin huyết thanh bò 3% trong TBS, với tổng thể tích là 100 μl và được ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ trên máy quay. 30 μl hạt Protein-G từ tính (Dynabeads ™ Protein G, Cat. Số 10009D, Invitrogen của Thermo Fisher Scientific, CA, USA) được thêm vào huyền phù mAb-phage và ủ trong 30 phút trên máy quay. MAb và phage không liên kết được loại bỏ khỏi hạt bằng cách rửa ba vòng với TBST (0,5% Tween-20 trong TBS) sử dụng giá đỡ từ tính. Các phage liên kết mAb được rửa giải bằng glycine-HCl pH 2,2 và trung hòa bằng Tris-HCl pH 9,1. Các phage rửa giải được sử dụng để lây nhiễm vào tế bào DH5αF + để khuếch đại như đã mô tả trước đây (Freund và cộng sự, 2015). Ba vòng khuếch đại và sàng lọc bổ sung được thực hiện cho mỗi mAb. Để xác nhận liên kết mAb với các phage đã chọn ái lực, các khuẩn lạc đơn lẻ đã được chọn và phát triển như các mẫu cấy nhỏ mà từ đó các chấm trên màng lọc nitrocellulose được chuẩn bị. Các bộ lọc đã bị chặn bằng cách sử dụng sữa tách béo 5% trong TBS trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, được thăm dò với mAbs (2 μg / ml) qua đêm ở 4 oC và sau đó được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể liên hợp HRP (1: 5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA, Hoa Kỳ). Tín hiệu được phát triển bằng cách sử dụng phản ứng hóa trị phát quang (ECL) nâng cao (Rhenium, Israel).

Chuẩn bị mẫu cho NGS

Phage từ sinh vật thứ 4 (và thư viện naïve) được sử dụng làm mẫu cho PCR sử dụng:

1: mồi giác: chứa trình tự Illumina “Bộ chuyển đổi A” theo sau bằng mã vạch 5 cơ sở (mã vạch = NNNNN) và sau đó là 4 mã vạch tương ứng còn lại 512–515 của Phân đoạn A, ngay trước trình liên kết sự liên tiếp:

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNACTGAAGTACCT 3 ’.

2: primer antisense: chứa trình tự Illumina “Adapter B” tiếp theo là các codon tương ứng với các dư 525–528 trong Phân đoạn B:

5 ’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAATGGATACACA 3 ’.

Cấu hình nhiệt là:

  1. 94 oC 5 phút
  2. 94 oC 1 phút
  3. 53 oC 1 phút
  4. 72 oC 20 s
  5. bước 2–4 × 35 chu kỳ
  6. 72 oC 5 phút

Các sản phẩm PCR khuếch đại đã được xác nhận kích thước trong gel agarose 2%. Các mẫu PCR được tinh chế trên hạt AMPure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) được pha loãng để có 10 nM, được gộp chung vào một ống duy nhất và gửi cho NGS (Illumina HiSeq High Output, SR60-V4).

Phân tích Motif của trình liên kết peptit

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Chúng tôi đã sử dụng nhiều trình liên kết peptit làm đầu vào cho thuật toán Motif Elicitation (MEME, “chế độ zoop”) (Bailey và Elkan, 1994) để khám phá mô típ trình liên kết. Xây dựng MERS CoV RBM hoàn nguyên dưới dạng MBP / GST liên hợp Các RBM MERS CoV đã hoàn nguyên được khuếch đại bằng PCR từ fth1 cấu tạo bằng cách sử dụng kem lót cảm giác # 10 và kem lót chống thấm # 11 có chứa trình tự chồng chéo cho NdeI, HindIII để liên kết maltose protein (MBP), và primer cảm giác # 12 và primer antisense # 13 chứa các trình tự chồng chéo cho BamHI và HindIII cho glutathione- S-transferase (GST). 

Sơn lót # 10–13:

10: 5’TTCCAGGGCATTTCACATATGAAGCCTCTTAAGTACAGCT 3 ’.

11: 5’GAGCCTTTCGTTTTATTTGAAGCTTATTTACTCAGTCATGGCAACAGT 3 ’.

12: 5’GATCTGGTTCCGCGTGGATCCAAGCCTCTTAAGTACAGCTAT 3 ’.

13: 5’GAGTGCGGCCGCAAGCTTTCACTCAGTCATGGCAACAGTTGA 3 ’.

Cấu hình nhiệt là:

  1. 94 oC 5 phút
  2. 94 oC 30 giây
  3. 50 oC 30 giây
  4. 72 oC 30 giây
  5. bước 2–4 × 35 chu kỳ
  6. 72 oC 5 phút

Các sản phẩm PCR khuếch đại đã được xác nhận về kích thước trong agarose 2% gel. Tất cả các sản phẩm PCR đã được tinh chế bằng cách sử dụng các hạt AMPure và được nhân bản vào NdeI / HindIII cắt bỏ vectơ pMAL-p5x-MBP cho các cấu trúc MBP và BamHI / HindIII cắt véc tơ pET30a-N6xHis-GST cho các cấu trúc GST sử dụng phản ứng lắp ráp Gibson.

Đối với cả hai hệ thống biểu hiện, các vectơ được biến đổi thành vi khuẩn E. coli BL21 Rosetta (DE3) (Novagen Merck, Darmstadt, Đức) và được sử dụng để tạo ra các cấu trúc MBP và GST bằng cách sử dụng 100 mM IPTG trong 5 giờ cảm ứng ở 37 oC.

Sản xuất và tinh chế protein 

Tế bào E. coli BL21 Rosetta (DE3) được biến nạp với plasmid tái tổ hợp mã hóa cho MERS CoV RBM kết hợp với MBP hoặc GST. Các tế bào biến nạp được nuôi trong môi trường 200 ml LB + 100 μg / ml ampicillin (đối với pMAL-p5x-MBP) hoặc 50 μg / ml kanamycin (đối với pET30a-N6xHis-GST) ở 37 oC. 

Khi môi trường nuôi cấy đạt đến OD600 nm = 0,6, 1 ml 100 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG, Bio-Lab, 162423) được thêm vào và ủ thêm 5 giờ ở 37 oC. Các mẫu vi khuẩn bão hòa được thu hoạch bằng cách ly tâm ở 5000 vòng / phút trong 10 phút. Viên vi khuẩn được đặt lại trong dung dịch đệm L ly giải (PBS chứa 0,1% Triton X-100, 0,2 M NaCl) và được ly giải bằng sóng siêu âm. Dịch ly tâm được làm rõ bằng cách ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng / phút trong 30 phút, phần nổi phía trên được loại bỏ. Các thể chứa đã được tạo thành viên được gắn lại bằng cách tiếp xúc với sóng siêu âm trong dung dịch đệm 40 ml có chứa urê 8 M (đá lạnh), sau đó được ủ với 200 μl hạt Niken qua đêm ở 4 oC trên máy quay để chiết xuất protein từ các thể chứa. 

Các protein dung hợp được tinh sạch bằng sắc ký ái lực ion kim loại trên hạt Sepharose-niken theo hướng dẫn của nhà cung cấp (Ni Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare Life Sciences, 17–5318–06) sử dụng cột trọng lực. Việc trao đổi đệm sau khi rửa giải được thực hiện bằng cách sử dụng bộ lọc ly tâm Amicon Ultra-15 30k đối với MBP và 10k đối với protein dung hợp GST (Merck; UFC903024, Ireland). Độ tinh khiết của protein được ước tính bằng cách sử dụng điện di trên gel polyacrylamide (12%). Sản lượng dao động từ 1 đến 7 mg protein tinh khiết trên 200 ml dịch nuôi cấy.

Phương pháp chích ngừa

Sáu con thỏ trắng cái New Zealand được mua từ Envigo, Tel Aviv, Israel. Thỏ được nuôi trong những điều kiện không có mầm bệnh cụ thể. Tất cả các quy trình được sử dụng trong nghiên cứu này đã được sự chấp thuận của Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật có tổ chức (IACUC) của Đại học Tel Aviv, Israel. Hai con thỏ (trọng lượng cơ thể 1,4 – 1,8 kg) cho mỗi kháng nguyên: E5 và E9, và hai con thỏ làm giàn đối chứng (MBP và GST) đã được miễn dịch với 0,5 mg / ml mỗi loại E5-MBP, E9-MBP và MBP được nhũ tương với hoàn thành Thuốc bổ trợ của Freund thông qua tiêm dưới da tại 5 vị trí khác nhau. Sau đó, ba liều kháng nguyên tăng cường bằng cách sử dụng xen kẽ MBP hoặc GST với thuốc bổ trợ Freund không hoàn chỉnh với khoảng cách giữa các liều là 18 ngày. Các mẫu máu trước miễn dịch và miễn dịch (5ml) được thu thập từ tĩnh mạch tai của mỗi con vật một ngày trước mỗi lần chủng ngừa hoặc tăng cường.

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA)

Các xét nghiệm ELISA được tiến hành để đánh giá sự gắn kết của kháng thể với các cấu trúc RBM khác nhau và để đo phản ứng của kháng thể ở động vật đã được miễn dịch.

Thử nghiệm chụp RBM

Các giếng đĩa ELISA được phủ qua đêm với 5 μg / ml các mAbs trung hòa khác nhau trong TBS. Tiếp theo, các đĩa được rửa bằng TBS, chặn bằng sữa tách béo 5% trong TBS và ủ với các phage hiển thị cấu trúc RBM (1010 phage / giếng). Giếng được rửa bằng TBST (0,05% Tween-20) và ủ với huyết thanh thỏ đa dòng kháng M13 (1: 10.000). Tiếp theo, các giếng được rửa và ủ với kháng thể chống thỏ dê kết hợp HRPconjugated (1: 5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA, USA). Sau một vòng rửa bổ sung, các giếng được phản ứng với chất nền TMB / E ELISA (Merck Millipore; ES001, USA). Độ hấp thụ được đo ở 650 nm sử dụng đầu đọc vi tấm (Bio Tek, Winooski, VT, USA). Tất cả các mẫu đều được thử nghiệm lặp lại và các thử nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần.

Phép đo liên kết kháng thể với cấu trúc MBP và GST 

Các protein dung hợp MBP và GST hiển thị cấu trúc RBM được sử dụng để phủ lên các giếng qua đêm (10 μg / ml trong TBS), rửa sạch bằng TBS, chặn bằng sữa tách béo 5% trong TBS và ủ với 2 μg / ml trung hòa mAbs, qua đêm ở 4 oC. Các kháng thể thứ cấp (liên hợp HRP) tương ứng với mỗi kháng thể trung hòa được thêm 1: 5000 vào sữa tách béo và ủ trong 45 phút ở nhiệt độ phòng (Phòng thí nghiệm Jackson ImmunoResearch, Inc, West Grove, PA, USA). Sau một vòng rửa bổ sung, các giếng được phản ứng với chất nền TMB / E ELISA (Merck Millipore; ES001, USA). Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 650 nm bằng đầu đọc vi tấm (Bio Tek, Winooski, VT, USA). Tất cả các mẫu đều được thử nghiệm lặp lại và các thử nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần.

Các xét nghiệm ELISA của huyết thanh thỏ

Đầu tiên, các mẫu huyết thanh được phân tích dựa trên các kháng nguyên miễn dịch hiển thị của phage (E5, E9) và phage đối chứng (fth1) được sử dụng trực tiếp để phủ lên các giếng ELISA và tuân theo quy trình chung ở trên với các mẫu huyết thanh được pha loãng 1: 10.000 trong sữa. Sau đó, phản ứng chống lại kháng nguyên protein S1 tăng đột biến MERS CoV tái tổ hợp được thử nghiệm bằng cách sử dụng bộ kit kháng MERS CoV ELISA (IgG) thương mại, (EI 2604–9601 G, EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck). Giếng được rửa bằng TBST và ủ với huyết thanh tiền miễn dịch hoặc miễn dịch đa dòng của thỏ (theo hướng dẫn của bộ kit), sau đó rửa và ủ với liên hợp HRP-kháng thể thứ cấp như đã mô tả ở trên.

Kết quả và thảo luận sau nghiên cứu

Vùng liên kết thụ thể SARS CoV năm 2002 (RBD, 193 axit amin) được xác định về mặt chức năng hai năm sau cái chết của bệnh nhân Zero (Li và cộng sự, 2003). Cấu trúc nguyên tử của RBD được giải quyết bằng cách phân tích nhiễu xạ tia X của đồng tinh thể của nó với thụ thể virus tương ứng, enzym chuyển đổi angiotensin 2 (ACE2) (Li và cộng sự, 2005) và sau đó bằng chất trung hòa mAb 80 R (Sui và cộng sự, 2004). Những đồng tinh thể này tiết lộ Motif Receptor Binding (RBM, dư lượng S432-T486); một chuyến du ngoạn kéo dài chạy dọc theo bề mặt lõi trung tâm của RBD và trình bày bề mặt hoạt động tiếp xúc trực tiếp với thụ thể cũng như mAb trung hòa cạnh tranh (Hình 1 A). Chúng tôi đã có thể tái tạo một RBM cô lập của SARS CoV (42 axit amin) liên kết với cả mAb trung hòa và thụ thể (Freund et al., 2015). 

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoVHình 1. Các miền liên kết thụ thể (RBD) của SARS CoV và MERS CoV. Biểu diễn xương sống của RBD của SARS CoV (A, PDBID: 2GHV) và MERS CoV (B, PDBID: 4KQZ) được hiển thị. Cả hai cấu trúc đều chứa lõi trung tâm chứa 5 sợi beta. Một chuyến du ngoạn để lại lõi (màu hồng), từ sợi beta 4, tạo thành một bề mặt mở rộng tiếp xúc với thụ thể vi rút và là mục tiêu trung hòa mAbs, do đó hình thành RBM như đã được xác nhận đối với SARS CoV ( Li và cộng sự, 2005 ) và MERS CoV ( liên kết hydro Lu và cộng sự, 2013 ). Sợi beta lõi thứ năm (màu tím), đóng vai trò như một chân lynch giúp ổn định cấu trúc. Chuyến tham quan RBM được tổ chức tại chỗ thông qua một “vòng lặp neo” (al, xanh lam) tạo thành với lõi RBD. Trong C so sánh chi tiết hơn về hai RBM được đưa ra. Ở đây, MERS CoV RBM phức tạp hơn rõ rệt được minh họa cho thấy một sợi beta bổ sung (màu tím) làm phức tạp hơn việc gấp và hình dạng so với RBM đơn giản của SARS CoV chỉ chứa hai sợi beta (đỏ và cam) cũng được chia sẻ trong RBM của MERS CoV . Cũng cần lưu ý vị trí của C503-C526 đisunfua ở vành của vòng neo của MERS CoV RBM.

Với sự xuất hiện của MERS CoV vào năm 2012, RBD của nó đã được kết tinh cùng với thụ thể tương ứng của nó, dipeptidyl peptidase 4 của người (huDPP4) (Lu et al., 2013), tiết lộ một bố cục cấu trúc thường tuân theo cấu trúc đã được làm sáng tỏ trước đây đối với SARS CoV. MERS CoV RBD chứa lõi trung tâm được ổn định với 5 sợi beta và một chuyến du ngoạn, bắt nguồn từ sợi beta thứ tư, chạy dọc theo bề mặt của lõi và quay trở lại, chèn vào sợi thứ năm sợi beta đóng vai trò như một chân lynch ổn định cấu trúc RBD nhỏ gọn (Hình 1B). 

Kiểm tra các đồng tinh thể MERS-CoV RBD với thụ thể của nó hoặc các mAbs trung hòa khác nhau (Ying và cộng sự, 2014; Zhang và cộng sự, 2018) xác nhận RBM, tuy nhiên, lớn hơn và phức tạp hơn rõ rệt so với SARS CoV. MERS CoV RBM (gốc K493-E565) bao gồm 73 axit amin và chứa ba sợi beta đáng kể ngoài một “vòng neo” (gốc P516-C525, Hình 1 C). Mặc dù, việc hoàn nguyên MERS CoV RBM tuân theo cùng một sơ đồ chung trước đây được sử dụng cho SARS CoV, vì quy mô và độ phức tạp lớn hơn của nó, nên không hiển nhiên là việc hoàn nguyên sẽ thành công. Cuối cùng, việc hoàn nguyên MERS CoV RBM đòi hỏi: 

  • Sản xuất một thư viện hiển thị phage tổ hợp toàn diện thể hiện chuyến du ngoạn RBM trong đó “vòng neo” được thay thế bằng một loạt các trình liên kết tổ hợp (3–7 axit amin ngẫu nhiên, xem (Hình1B). Cần thiết phải xây dựng thư viện dưới dạng dung hợp Protein 3 (so với Protein 8 để biểu hiện SARS CoV RBM). Hơn nữa, cặn C526 được giữ lại như một phần của RBM để đảm bảo đisunfua với C503 ổn định RBM. 
  • Lựa chọn ái lực của các bộ biến đổi chức năng bằng cách sàng lọc thư viện phage dựa trên bảng điều khiển gồm 7 mAbs trung hòa.

Xây dựng thư viện trình liên kết tổ hợp tuân thủ

Trình tự oligonucleotide RBM (tương ứng với các gốc K493-E565, 73 axit amin) được nhân bản vào gen thực khuẩn thể 3 ở hai đoạn, A: K493-P515 và B: C526-E565, được kết nối thông qua một chuỗi 5 trình tự liên kết tổ hợp có chiều dài từ 3 đến 7 axit amin (xem Tài liệu và Phương pháp). Một mẫu của thư viện trình tuân thủ đã được phân tích bởi Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) và được tóm tắt trong Hình 2, xác nhận rằng các trình liên kết ở mọi kích thước đều được đại diện tốt. Hơn nữa, đối với các trình liên kết từ 4 gốc trở lên, hầu hết các trình liên kết là duy nhất, tức là, xuất hiện một lần trong mẫu đã được giải trình tự. Tổng độ phức tạp lý thuyết của 3 trình liên kết dư chỉ là 8000 (203) và do đó hầu hết các trình liên kết trimer xuất hiện dưới dạng nhiều bản sao.

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 2 . Phân tích NGS của thư viện bộ tuân thủ MERS CoV. Thư viện bộ phù hợp hiển thị phage được xây dựng cho MERS CoV đã được NGS phân tích. “Vòng neo” được thay thế bằng các trình liên kết tổ hợp có chiều dài từ 3–7 axit amin. Biểu đồ hình tròn cho thấy sự phân bố của các liên kết peptit có độ dài khác nhau. Biểu đồ cung cấp số lượng trình liên kết peptit duy nhất trên một triệu lần đọc được tìm thấy một lần, hai lần hoặc 10–3000 lần cho mỗi độ dài trình liên kết. Vì vậy, ví dụ, gần 8000 trình liên kết heptamer khác nhau xuất hiện một lần và gần 2000 trình liên kết trimer khác nhau được phát hiện 3–10 lần.

Ban đầu, chúng tôi đã sàng lọc thư viện tuân thủ đối với protein thụ thể MERS CoV, huDPP4, nhưng không thành công, không có cấu trúc nào được chọn ái lực. Việc kiểm tra chi tiết MERS CoV RBD được tạo phức với huDPP4, cho thấy rằng một dư lượng quan trọng của thụ thể, dư lượng R336, tiếp xúc với dư lượng RBM Y499. Tuy nhiên, dư lượng thiết yếu bổ sung của RBD, dư lượng L450-Q466, nằm trong lõi của RBD, và do đó không được đưa vào cấu trúc RBM trong thư viện của chúng tôi. Các gốc này đã được chứng minh là đặc biệt quan trọng đối với sự gắn kết với thụ thể (xem Hình 3). Hơn nữa, phần còn lại của thụ thể, R336, đã được xác định là không thể thiếu đối với liên kết RBD (Peck và cộng sự, 2017; Song và cộng sự, 2014; van Doremalen và cộng sự, 2016; Wang và cộng sự, 2013). Tiếp điểm của R336 với hai gốc RBD, D455 và P463, có tầm quan trọng đặc biệt (van Doremalen và cộng sự, 2014). Như đã chứng minh, sự đột biến của bất kỳ ai trong số ba gốc này (D455 và P463 của RBD hoặc R336 của huDPP4) loại bỏ hoàn toàn liên kết thụ thể (Lu và cộng sự, 2013). Thực tế là hai gốc axit amin RBD quan trọng (D455 và P465) bị loại trừ khỏi thư viện RBM của chúng tôi sẽ giải thích sự thiếu thành công trong việc cô lập các cấu trúc RBM liên kết thụ thể.

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 3 . RBD tiếp xúc-dư lượng với dư lượng R336 của huDPP4 . Hai chế độ xem của MERS CoV RBD cho thấy bản trình bày xương sống của lõi và phần lấp đầy khoảng trắng (màu hồng) của RBM (vòng neo màu xanh lam được hiển thị như đường trục). Các phân đoạn liên kết của huDPP4 được hiển thị bằng màu xanh lục. Dư lượng R336 của huDPP4 được thể hiện bằng màu lục lam. Y499 của RBM tiếp xúc với R336, tuy nhiên hai phần dư quan trọng, P463 và D455 của lõi (được hiển thị trong CPK tô màu, được tô màu) tiếp xúc với R336 và rất cần thiết để liên kết huDPP4 với MERS CoV RBD.

Sàng lọc thư viện và lựa chọn sở thích của những người kết hợp đã hoàn nguyên

Chúng tôi đã tiến hành điều chỉnh lại RBM bằng cách sàng lọc thư viện để chống lại việc trung hòa mAbs. Một bảng gồm 7 mAbs trung hòa đã được thu thập để liên kết MERS CoV RBM thông qua nhiều loại dư lượng tiếp xúc. Cơ sở lý luận là một RBM gấp lại về mặt chức năng giả định cấu trúc sinh lý chính xác, phải có thể được nhận ra bởi ít nhất hai mAbs trung hòa nhạy cảm với cấu trúc khác nhau (Gorny và cộng sự, 2002). 

Hình 4 A cho thấy sự phân bố dư lượng tiếp xúc ở hai bên của vòng neo đối với mỗi trong số sáu mAbs mà các đồng tinh thể có sẵn và để so sánh các tiếp điểm cho huDPP4. Các mAb khác nhau ở điểm yêu cầu của chúng về dư lượng tiếp xúc trong RBM. Ví dụ: mAb m336 tạo ra 28 địa chỉ liên hệ với RBM được phân phối ở hai bên của “vòng lặp neo”, trong khi m338 và CDC-C2 tạo phần lớn các địa chỉ liên hệ chỉ ở phía dưới “vòng lặp neo”. Do đó, mỗi mAb đưa ra một tập hợp các yêu cầu tuân thủ khác nhau đối với ràng buộc RBM (được minh họa thêm trong Hình 4B). Cũng vì vậy mà cấu trúc phản ứng chéo với nhiều mAbs nên được xem là đáp ứng một loạt các ràng buộc về cấu trúc quan trọng đối với việc nhận biết kháng thể. Mỗi 7 mAbs được sử dụng để sàng lọc thư viện tuân thủ theo ba lần và các phage được làm giàu được gửi đến NGS. Như được minh họa trong Bảng 2, nhiều trình liên kết đã được tìm thấy cho các cấu trúc RBM được làm giàu ái lực bởi tất cả 7 mAbs. Mặc dù một số liên kết ngắn, 3 axit amin và 4 axit amin đã được chọn; phần lớn các trình liên kết hiệu quả dài 5 và 7 phần còn lại. Xem xét các biến thể trong thành phần trình liên kết, người ta có thể dễ dàng gán nhiều trình tự liên kết vào 5 mô hình được thể hiện trong Hình 5. Lưu ý rằng phần dư Leucine chiếm ưu thế cho vị trí đầu tiên trong nhiều trình liên kết cũng như phần dư Leucine ở vị trí thứ ba, Proline là phổ biến ở vị trí hai và ba. 

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 4 . Tiếp xúc dư lượng được sử dụng bởi MERS CoV trung hòa mAbs. A) Các gốc tiếp xúc được cho trong Hình 3 được thể hiện trong các mô tả xương sống của MERS CoV RBD. RBM có màu hồng, vòng neo màu xanh lam. Các chất cặn tiếp xúc với huDPP4 có màu xanh lục. Các tiếp điểm độc quyền của RBM tiếp xúc với huDPP4 (dưới cùng bên phải) được hiển thị bằng dấu hoa thị (xem thêm Hình 3 ). B) MERS CoV RBM kéo dài từ K493 đến E565 (73 axit amin) và chứa một “vòng neo” (từ Q516 đến P525, được tô bóng màu xanh lam nhạt). Sáu mAbs trung hòa đã được đồng kết tinh với MERS CoV RBD và cấu trúc nguyên tử của chúng đã được giải quyết ( Lingshu và cộng sự, 2021 , Xu và cộng sự, 2019 ,Ying và cộng sự, 2015 , Zhang và cộng sự, 2018 ). Như được minh họa, mỗi mAb sử dụng một loạt các địa chỉ liên hệ để ràng buộc RBM của vi-rút , không có liên hệ nào nằm trong “vòng lặp neo”. Để so sánh, các điểm tiếp xúc với thụ thể MERS CoV, huDPP4, được đưa ra. Lưu ý rằng ba dư lượng tiếp xúc huDPP4 (R505, P515 – dấu hoa thị màu xanh lá cây và A562 – dấu hoa thị màu đỏ) không trực tiếp góp phần nhận dạng mAb.

Bảng 2. Phân tích NGS của 25 dòng RBM. Thư viện tuân thủ MERS CoV đã được sàng lọc với 7 mAbs và các phage được chọn theo ái lực được gửi đến phân tích NGS. Các trình tự cho các trình liên kết khác nhau được sử dụng để thay thế “vòng lặp neo” đã được xác định và được xếp hạng cho SUM lần đọc được ghi cho tất cả bảy mAbs. Cũng được hiển thị là số mAbs (#mAbs) mà các lần đọc được phát hiện. Các liên kết mà “Tên” được cung cấp (các hàng được đánh dấu) là những liên kết cũng được chọn và xác nhận theo cách thủ công dưới dạng chất kết dính như được minh họa (xem văn bản). Lưu ý, 5 trình liên kết được mô tả trong Hình 7 được in đậm.

# Tên Người liên kết m-336 m-337 m-338 C-12 F-11 JC57-11 CDC-C2 mAbs TỔNG
1 D8 LALSA 828.420 936.441 705.321 236.722 787.062 881,111 875.784 7 5250.861
2 A11 QPPTE 6421 8833 15.310 35.710 93.455 33.310 25,934 7 218,973
3 E5 LHPDHPD 19,234 12.271 33.687 2428 5061 20.025 10.440 7 103.146
4 LRT 22.934 889 4707 48.882 8058 1730 15.589 7 102.789
5 NRG 13.415 – 4600 34.760 36 1111 900 6 54.822
6 BC10 MAPQT 2619 347 2729 30.823 3827 1958 2090 7 44.393
7 G3 LSKEY 3327 213 13,942 1656 1266 2051 184 7 22.639
8 BA5 LPRKE 10.266 1330 1758 4470 5 1 3165 7 20.995
9 ED2 YDLFVKE 2331 96 335 162 13.174 4659 177 7 20,934
10 BB2 LNHAE 2690 94 12,733 3293 42 108 224 7 19.184
11 LSRDS 1061 185 12.009 3387 – 967 0 5 17.609
12 LEMHE 1247 – 8402 1960 230 2311 1 6 14.151
13 MNRLSDA 461 – 12.068 – – 1 0 3 12.530
14 EC2 LPPEE 380 305 4862 278 4668 1224 728 7 12.445
15 AA5 VPVHR 2074 484 4387 101 4926 125 170 7 12.267
16 LSAHSPE 183 – 11.781 – – – 90 3 12.054
17 SNQ – 90 238 – – 10.648 941 4 11,917
18 BC3 LPRHN 3290 1588 2979 63 – 1916 540 6 10.376
19 EC6 YSVPVST 616 – 417 5113 2712 – 213 5 9071
20 ETIPSYN 3999 163 366 1457 19 235 2512 7 8751
21 MFPTDPK 129 – 7882 – – – 0 2 8011
22 BB6 LSPTE 2503 202 3360 – 385 2 840 6 7292
23 BA3 LSNEA 1412 4 4463 2 – 574 0 5 6455
24 LSATNSA 53 – 6118 – – – 0 2 6171
25 E9 LPLQA 133 267 321 14 36 302 2 7 1075

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 5 . Chỉ định các mô típ MEME cho các trình liên kết phản ứng chéo. Hơn 1000 dòng vô tính từ việc sàng lọc của thư viện tuân thủ đã được chọn và kiểm tra thủ công cho mỗi loại trong số 7 mAbs trung hòa được sử dụng trong nghiên cứu này. Các trình liên kết sau hỗ trợ liên kết ít nhất hai mAbs khác nhau: LALSA, QPPTE, LSKEY, LPLQA và LHPDHPD. Hơn nữa, các peptit được chọn theo sở thích từ các màn hình này đã được gửi đến NGSphân tích. 1415 trình liên kết ngũ bội và 242 trình liên kết heptameric được tìm thấy có hơn 1000 bản sao và phản ứng chéo với ít nhất hai mAbs. Sử dụng thuật toán MEME (REF), các trình liên kết 17, 15, 10, 28 và 33 có thể được chỉ định cho các trình liên kết LALSA, QPPTE, LSKEY, LPLQA và LHPDHPD, tương ứng. Các mô típ được MEME xác định bằng cách sử dụng 1657 peptit (pentamers + heptamers) tương ứng tốt với 5 trình liên kết thu được bằng tay.

Để xác nhận rằng các chuỗi trình tự liên kết được làm giàu thực sự tạo ra các RBM được hoàn nguyên chức năng liên kết vật lý với mAbs, chúng tôi đã sàng lọc thủ công thư viện đối với mAbs, chọn hơn 1000 bản sao cho mỗi bản sao và kiểm tra liên kết mAb bằng lớp phủ chấm đốm như được minh họa trong Hình. 6. Các trình tự liên kết của các dòng dương tính đã được xác định và tìm thấy tương ứng với các trình tự liên kết được làm giàu nhất mà các phân tích NGS đã thấy trước đây trong silico, do đó xác nhận khả năng của chúng thực sự hỗ trợ các phù hợp được công nhận bởi hội đồng kháng thể trung hòa (xem Bảng 2). Hình 7 cho thấy sự liên kết của năm dòng vô tính được chọn với tất cả 7 mAbs.

Đặc biệt, hai bản sao, E5 và E9, được phát hiện có phản ứng chéo trên diện rộng. Hai chất kết hợp này sau đó được biểu hiện dưới dạng protein dung hợp của protein liên kết maltose (MBP) và glutathione-S-transferase (GST), do đó kiểm tra khả năng liên kết của chúng dưới dạng các biểu mô đơn hóa trị so với trình bày đa hóa trị của chúng (5 bản sao Protein-3 trên mỗi phage) trong bối cảnh của các phage. Hình 8 mô tả sự ràng buộc của bốn cấu trúc đối với tất cả 7 mAbs. Nói chung, cấu trúc MBP của bộ tuân thủ E9 cho thấy liên kết mAb phản ứng chéo cao nhất. GST cũng hỗ trợ đại diện chức năng của hai bộ định tuyến.

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 6 . Phát hiện dấu chấm của các bản sao MERS CoV RBM được mAb m336 nhận dạng. Đối với mỗi mAbs khác nhau, 1000 bản sao tuân thủ hiển thị phage được chọn và kiểm tra thủ công về liên kết mAb bằng các chấm trên màng lọc nitrocellulose. Ví dụ về phân tích như vậy đối với mAb m336 được hiển thị minh họa việc phát hiện 9 dòng vô tính dương tính (để biết chi tiết xem Phương pháp). Thực khuẩn thể kiểu hoang dã fth1 (*) hiển thị mức độ liên kết nền trong khi một “chấm” m336 mAb được đưa ra như một đối chứng dương (**).

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 7 . MERS CoV RBM được hoàn nguyên liên kết mAbs trung hòa. Bảy mAbs trung hòa, được sử dụng trong nghiên cứu này, cho thấy các mức độ liên kết phản ứng chéo khác nhau với năm RBM đã hoàn nguyên, được đo bằng ELISA . Không tìm thấy ràng buộc đáng kể nào đối với RBM “Độ dài đầy đủ” (dư lượng K493-E65, FL ) hoặc dạng “Không có vòng” ( LL ) của RBM trong đó “vòng lặp neo” (Q516-P525) đã bị xóa. Các trình tự liên kết kết nối các gốc 515–526 được đưa ra trong Bảng 2 cùng với liên kết tương đối của chúng với các mAbs khác nhau. Tất cả các cấu trúc đã được hiển thị bằng phage; kiểu hoang dã fth1 thực khuẩn hoang dãcung cấp một đường cơ sở kiểm soát tiêu cực. Các giá trị được hiển thị là giá trị trung bình của ba thử nghiệm độc lập và sai số tiêu chuẩn của chúng.

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 8 . Các protein tổng hợp MERS CoV RBM được hoàn nguyên liên kết các mAbs trung hòa. Bảy mAbs trung hòa, được sử dụng trong nghiên cứu này, cho thấy các mức độ liên kết phản ứng chéo khác nhau với các RBM hoàn nguyên có phản ứng chéo nhất (E5 và E9), được đo bằng ELISA . Hai cấu trúc được kết hợp với MBP và GST ; MBP và GST không liên hợp cung cấp các biện pháp kiểm soát tiêu cực để thiết lập ràng buộc đường cơ sở. Các giá trị được hiển thị là giá trị trung bình của ba thử nghiệm độc lập và sai số tiêu chuẩn của chúng.

Kiểm tra khả năng sinh miễn dịch của các cấu trúc

Câu hỏi tiếp theo mà chúng tôi giải quyết là liệu cấu trúc MBP hoặc GST E5 và E9 có gây miễn dịch hay không. Để xác minh điều này, thỏ đã được chủng ngừa với cấu trúc MBP E5 và E9, sau đó được tăng cường xen kẽ giữa cấu trúc MBP hoặc GST. Những con thỏ đối chứng đã được chủng ngừa và tăng cường sức khỏe chỉ với giàn MBP / GST. Huyết thanh miễn dịch trước và miễn dịch cuối cùng được thu thập và kiểm tra khả năng liên kết cụ thể các cấu trúc E5 và E9 biểu hiện trên phage. Như được minh họa trong Hình 9 , thỏ được chủng ngừa E5 và E9 hoạt động mạnh mẽ phản ứng kháng thể mạnh mẽđối với RBM đã hoàn nguyên so với nền không đáng kể theo huyết thanh của động vật đối chứng. Sau đó, chúng tôi kiểm tra xem các kháng thể đặc hiệu RBM có phản ứng chéo với protein tăng đột biến MERS CoV chính hãng hay không. Đối với điều này, huyết thanh đã được kiểm tra bằng cách sử dụng kit Euroimmun Anti-MERS CoV ELISA (IgG) thương mại, trong đó protein đột biến MERS CoV tái tổ hợp được cung cấp làm kháng nguyên tham chiếu. Như được chứng minh trong Hình 10 , cả cấu trúc E5 và E9 đều tạo ra các kháng thể đặc hiệu tăng đột biến phản ứng chéo mạnh mẽ.

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 9 . Khả năng sinh miễn dịch của RBM MERS CoV được tái tạo. Mẫu huyết thanh của hai con thỏ được chủng ngừa bằng E5-MBP hoặc E9-MBP cho thấy các mức độ liên kết phản ứng chéo khác nhau với thể thực khuẩn được hiển thị E5 và E9 MERS-CoV RBM hoàn nguyên, được đo bằng ELISA . Huyết thanh tiền miễn dịch và huyết thanh đối chứng (có nguồn gốc từ động vật được miễn dịch đơn thuần bằng giá thể) cho điểm kiểm soát âm tính. Các giá trị được hiển thị là giá trị trung bình của ba thử nghiệm độc lập và sai số tiêu chuẩn của chúng.

Phục hồi chức năng của mô-típ gắn kết thụ thể MERS CoV

Hình 10 . Phản ứng chéo gắn kết huyết thanh với kháng nguyên S1 MERS CoV tăng đột biến tái tổ hợp. Các mẫu huyết thanh của hai con thỏ được chủng ngừa bằng E5-MBP hoặc E9-MBP cho thấy sự gắn kết phản ứng chéo với kháng nguyên S1 MERS CoV tái tổ hợp so với một con thỏ Đối chứng (chỉ được miễn dịch bằng giá thể). Bộ EUROIMMUN được sử dụng cung cấp ba giếng điều khiển (màu xanh lam đậm): một “Calibrator”, điều khiển Tích cực và Tiêu cực. Bộ hiệu chuẩn đại diện cho giới hạn trên của những gì có thể là phản hồi tiêu cực. Do đó, các giá trị trên Bộ hiệu chuẩn đại diện cho ràng buộc dương thực sự trong khi bên dưới Bộ hiệu chuẩn nên được coi là âm. Mức độ liên kết huyết thanh và phản ứng chéo cao hơn mức độ gắn kết với Chất hiệu chuẩn. Các thanh lỗi được hiển thị.

Vùng liên kết thụ thể coronavirus (RBD, khoảng 200 axit amin) chỉ đại diện cho 18% protein đột biến của virus , nhưng nó lại là thành phần quan trọng xác định tính nhiệt tính của virus . Kiểm tra thêm về thụ thể: Tương tác RBD đã dẫn đến việc xác định RBM, một cuộc du ngoạn của một số 50–70 axit amin cung cấp một loạt các điểm tiếp xúc với thụ thể. RBM được tổ chức thông qua một tập hợp liên kết hydrođược hình thành giữa lõi của RBD và một “vòng neo” chiếu từ bề mặt liên kết thụ thể. Trước đây, chúng tôi đã phát hiện ra rằng sự thay thế “vòng neo” của SARS-CoV, bằng một loạt các trình liên kết tổ hợp cho phép biểu hiện và lựa chọn các RBM đã hoàn nguyên có chức năng liên kết với kháng thể trung hòa đặc hiệu SARS cũng như ACE2. Do đó, RBM đại diện cho một chất sinh miễn dịch đích, một bề mặt trung hòa để sản xuất vắc xin dựa trên epitope ( Gershoni, 2019 , Gershoni và cộng sự, 2007 ).

Ở đây chúng tôi mô tả việc triển khai các bài học kinh nghiệm từ SARS CoV đến việc hoàn nguyên MERS CoV RBM. Mặc dù các đặc điểm cấu trúc chung của RBD được xác định cho SARS cũng tồn tại đối với MERS, việc tái tạo RBM của MERS CoV là thách thức hơn rõ rệt. MERS CoV RBM liên kết với một thụ thể hoàn toàn khác và cấu trúc của nó phức tạp hơn về mặt cấu trúc vì bề mặt liên kết của thụ thể bao gồm ba sợi beta chống song song và lớn hơn rõ rệt so với bề mặt được tìm thấy đối với SARS CoV (55 axit amin so với 73 axit amin) . Việc hoàn nguyên yêu cầu thay thế “vòng lặp neo” bằng một thư viện toàn diện gồm các trình liên kết tổ hợp cho phép lựa chọn các RBM đã hoàn nguyên phản ứng chéo với một bảng gồm 7 mAbs trung hòa. Hai trong số các thiết bị định hình này, E5 và E9, đã được chứng minh là tiếp tục trình bày RBM phản ứng chéo chức năng như các protein dung hợp MBP và GST. Hơn nữa, hai phương thức này đã được chứng minh là có khả năng sinh miễn dịch ở thỏ và có thể tạo ra các kháng thể đặc hiệu RBM phản ứng chéo với protein đột biến MERS CoV chính hãng. E5 và RBM hoàn nguyên E9 hiện đang được tiếp tục phát triển dưới dạng vắc xin dựa trên epitope. Đối với điều này, các cấu trúc đa lượng hóa trị (Correia và cộng sự, 2014 , He và Zhu, 2015 , Kulp và Schief, 2013 , Marcandalli và cộng sự, 2019 , Sesterhenn và cộng sự, 2020 ) và giàn giáo thay thế ( Morris và cộng sự, 2017 , Negahdaripour và cộng sự, 2017 , Saylor và cộng sự, 2020 ) đang được xem xét.

Kết luận

Nhu cầu sản xuất một phương thức vắc-xin cho MERS CoV là vô cùng cần thiết vì tỷ lệ tử vong đối với bệnh MERS CoV là rất cao. Tỷ lệ lưu hành MERS CoV trên toàn cầu thấp không phải là lý do để bác bỏ mối lo ngại này. Các trường hợp nhiễm MERS CoV hàng năm kết hợp với sự gia tăng ngày càng tăng của các trường hợp nhiễm SARS CoV2 ở Trung Đông, cùng với tỷ lệ lưu hành MERS CoV cao trong quần thể lạc đà, có thể dẫn đến sự tái tổ hợp di truyền của hai beta-coronavirus này. Hậu quả của một sự kiện như vậy sẽ rất tàn khốc. Do đó, chúng tôi tin rằng việc theo đuổi chất sinh miễn dịch dựa trên MERS CoV RBM được mô tả trong nghiên cứu này, có thể cung cấp câu trả lời trước nếu sự phát triển như vậy xảy ra.

Các chủ đề liên quan

Dưới đây là một số bài viết về các chủ đề nghiên cứu có liên quan đến hoạt chất Sulforaphane và công dụng của chúng:

Tham vấn chuyên môn