Tác dụng bảo vệ của chiết xuất bông cải xanh và Sulforaphane chống lại sự căng thẳng oxy hóa

Sullab Admin

3 năm trước

Tổng quan
1. Nguyên liệu và phương pháp
2. Kết quả
3. Kết luận
4. Các chủ đề liên quan
5. Tham vấn chuyên môn

Căng thẳng oxy hóa là tình trạng gì? Sulforaphane chống lại sự căng thẳng oxy hóa như thế nào? Tác dụng chống oxy hóa của Sulforaphane đến từ cơ chế nào?

Tổng quan

Hoạt động chống oxy hóa của chiết xuất bông cải xanh và các hợp chất tinh khiết của nó (polyphenol và Sulforaphane tinh khiết (PSF)) đã thu hút được nhiều sự chú ý từ các nhà nghiên cứu trong thời gian gần đây. Chiết xuất bông cải xanh và SF bảo vệ tế bào B16 khỏi H2 O2- giảm stress oxy hóa thông qua việc tăng tổng khả năng chống oxy hóa (T-AOC), tăng các hoạt động của NADPH dehydrogenase quinone1 (NQO1), catalase (CAT), và giảm hàm lượng malondialdehyde (MDA).

Western blot và qRT-PCR cho thấy rằng sự biểu hiện của yếu tố nhân erythroid 2 liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2), NQO1 và heme oxygenase 1 (HMOX-1) đã tăng lên. Chất chiết xuất từ bông cải xanh tốt hơn SF trong việc cải thiện T-AOC, hoạt động của enzym chống oxy hóa (đặc biệt là NQO1) và giảm hàm lượng MDA. Polyphenol và PSF được tách ra từ dịch chiết bông cải xanh bằng phương pháp sắc ký phản dòng tốc độ cao (HSCCC). Chúng có thể làm tăng đáng kể hoạt động T-AOC và NQO1 ( P <0,05). PSF làm tăng hoạt động của các enzym Pha 2 nhiều hơn so với polyphenol. Chiết xuất bông cải xanh bảo vệ tế bào B16 khỏi H2 O2 -gây ra căng thẳng oxy hóa thông qua tăng cường con đường tín hiệu Nrf2 / Keap1. Sự bảo vệ chủ yếu là do SF, tiếp theo là polyphenol.

1. Nguyên liệu và phương pháp

1.1. Vật liệu

Một cây bông cải xanh được mua từ chợ địa phương (Hàng Châu, Trung Quốc). Chất ức chế protease , thuốc thử phát quang ECL , bộ xét nghiệm protein Bradford và Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) được mua từ Sangon Biotech Co., Ltd. (Thượng Hải, Trung Quốc). Chất chuẩn polyvinylidene fluoride (PVDF) và DL-Sulforaphane được cung cấp từ Sigma-Aldrich (Missouri, USA). Sữa bột tách béo giàu protein và canxi được lấy từ NZMP (Fonterra, New Zealand). Các hóa chất khác được sử dụng trong nghiên cứu là loại phân tích của Công ty TNHH Thuốc thử Hóa chất Sinopharm (Thượng Hải, Trung Quốc).

1.2. Chế phẩm chiết xuất từ bông cải xanh

Chất chiết xuất từ bông cải xanh thu được theo phương pháp của Wu et al (2018) với một số sửa đổi. Bột bông cải xanh (200 g) được trộn với 340 mL dung dịch đệm phosphat 0,1M (pH 5,8) và 660 mL etyl axetat , và được giữ ở 25°C trong 4 giờ. Sau đó, natri clorua (60 g) được thêm vào hỗn hợp và trộn kỹ. Dịch lọc thu được bằng cách lọc hút, và phần cặn được rửa bằng các thể tích bằng etyl axetat. Sau đó, các lớp etyl axetat được trộn, 10g natri sunfat khan được thêm vào hỗn hợp để loại bỏ nước dư. Bộ lọc đã được làm khô thông qua cô quay ở 50°C. Phần cặn được hòa tan bằng metanol trong bình định mức 25 mL và duy trì ở -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo.

1.3. Định lượng tổng số ITC

Nội dung của ITC được phân tích bằng phương pháp xyclocondensation thông qua sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) theo Liu et al (2017) với một vài sửa đổi nhỏ. Tóm lại, dịch chiết bông cải xanh được ủ với kali 25 mM đệm phosphat và 10 mM 1,2-benzenedithiol ở 65 ° C trong 2 giờ. Hỗn hợp ly tâm (12.000 g , 10 phút) được đo bằng cột pha ngược C18 (WondaCract ODS-2, 5 μm, 4,6 × 250 mm, Shimadzu, Nhật Bản) được gắn với hệ thống Agilent HPLC (Agilent Technologies Inc., California , HOA KỲ). Hệ dung môi được vận hành với 80% metanol (v / v) và 20% nước (v / v) với tốc độ dòng 1,0 mL / phút ở bước sóng 365 nm. Chất chuẩn là allyl isothiocyanate(12,5–200 μM).

1.4. Quá trình oxy hóa tế bào B16 bị tổn thương

Tế bào hắc tố chuột B16 được nuôi cấy theo phương pháp của Qarawi và cộng sự (2011). Mô hình tổn thương oxy hóa của tế bào B16 được thiết lập theo phương pháp của Sun et al. (2017) với một số sửa đổi. Tóm lại, huyền phù tế bào đơn được cấy vào vi mẫu 96 giếng (2×10 4 tế bào / giếng trong 100 µL môi trường) và được nuôi cấy với 5% CO 2 ở 37°C trong 24 giờ. Tế bào được rửa bằng PBS và ủ với 0,8 mM H 2 O 2. Dung dịch không có H2 O2 đã được lấy làm kiểm soát. Sau đó, 20 μL 5 mg / mL MTT được thêm vào mỗi giếng sau khi loại bỏ môi trường. Tiếp tục ủ trong 4 giờ nữa. DMSO (150 μL) được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 10 phút. Cuối cùng, tấm được đọc bằng máy quang phổ UV / Vis (Jasco Model 7800, Nhật Bản) ở bước sóng 570 nm. Khả năng sống của tế bào được tính bằng cách chia độ hấp thụ của mỗi mẫu thử nghiệm cho mẫu đối chứng tương ứng.

1.5. Tổng số protein chiết xuất từ tế bào

Các tế bào trong giai đoạn tăng trưởng logarit được tiêu hóa bằng trypsin có chứa EDTA để chuẩn bị huyền phù tế bào đơn, được gieo vào đĩa 6 giếng với 2 mL vi mẫu (7 × 10 5 tế bào/ giếng trong 100 µL môi trường) và được nuôi cấy với 5% CO 2 ở 37°C trong 24 giờ. Sau khi tế bào bám vào thành, môi trường nuôi cấy được hút ra ngoài và rửa sạch bằng PBS. Các môi trường nuôi cấy với các nồng độ khác nhau của SF và chất chiết xuất từ bông cải xanh được thêm vào và ủ trong 24 giờ. Sau đó, hỗn hợp được thêm vào 0,8 mM H2 O2 và ủ trong 2 giờ. Hỗn dịch tế bào được ly tâm ở 5000g trong 5 phút sau khi tiêu hóa. Kết tủa được thu thập và thêm vào lysate tế bào, DTT và chất ức chế protease (200: 1: 2) trong 30 phút. Hỗn hợp được ly tâm ở 12.000 g và 4°C trong 30 phút. Phần nổi phía trên được duy trì ở -80°C cho các thí nghiệm tiếp theo.

1.6. Phân tích hoạt động NQO1, CAT, MDA và T-AOC

Hoạt động NQO1 được xác định theo phương pháp của Liu et al (2017) với một số sửa đổi nhỏ. Việc chiết xuất protein ở trên được trộn với đệm Tris-HCl (25 mM), BSA (0,67 mg / mL), Tween-20 (0,01%, v / v), NADP + (0,03 mM), glucose-6-phosphate ( 1 mM), FAD (5 µM), glucose-6-phosphat dehydrogenase (2 U / mL), MTT (0,72 mM) và menadione (50 µM) với tỷ lệ 1: 4. Hỗn hợp được đo bằng đầu đọc tấm µQuant (BioTek, Winooski, VT, USA) ở bước sóng 610 nm (cứ sau 60 giây trong 7 phút). Dicumarol (0,3 mM, 50 µL) được sử dụng để dừng phản ứng. Độ hấp thụ được đo trong 5 phút nữa để hiệu chỉnh hoạt tính cụ thể của không NQO1. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford với tiêu chuẩn BSA ( Li và cộng sự, 2020). Hoạt động cụ thể của NQO1 được xác định là nM MTT giảm / phút / mg protein. Catalase (CAT), malondialdehyde (MDA) và tổng khả năng chống căng căng thẳng oxy hóa (T-AOC) được phân tích lần lượt theo bộ xét nghiệm CAT , bộ xét nghiệm MDA và bộ xét nghiệm T-AOC (Nanjing Jiancheng Bioengineering Insitute).

1.7. Phân tích Western blot

Phân tích Western blot của NQO1, HMOX1 , Keap1 và Nrf2 được thực hiện theo phương pháp của Moreira et al (2015). Các chiết xuất protein tế bào B16 ở trên được sử dụng làm vật liệu thí nghiệm. Hàm lượng protein được xác định bằng cách sử dụng thuốc thử Bradford. Các protein trong mỗi mẫu được xác định bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfate polyacrylamide, được chuyển sang màng polyvinylidene difluoride và tiếp xúc với các kháng thể thích hợp (anti-NQO1 (1: 1000), anti-HMOX1 (1: 1000), anti-Keap1) ( 1: 1000), chống NFE2L2 (1: 1000) (Sangon Biotech Co., Ltd., Trung Quốc) và chống β-actin (1: 1000) (Sigma-Aldrich, Missouri, Hoa Kỳ)). Các protein được hình dung bằng cách sử dụng sự phát quang hóa học tăng cường hệ thống phát hiện (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) với kháng thể thứ cấp chống thỏ hoặc chuột liên hợp với peroxidase của cây cải ngựa. Các dải protein được chuẩn hóa thông qua hệ thống phân tích đo mật độ ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

1.8. Phân tích qRT-PCR

Các tế bào được nuôi cấy qua đêm và được xử lý trước với các nồng độ khác nhau của SF và chiết xuất bông cải xanh trong 24 giờ. Hỗn hợp không có môi trường nuôi cấy được thêm vào H2 O2 và ủ trong 2 giờ. Sau khi ủ, RNA tổng số được phân lập từ tế bào B16 bằng thuốc thử Trizol (Invitrogen, USA). Phiên mã ngược được thực hiện theo phương pháp của Islam et al (2014). Bảng 1 sẽ hiển thị trình tự mồi PCR của các gen. QRT-PCR được thực hiện trên máy quay vòng nhiệt LightCycler® Nano (Roche Applied Science, Penzberg, Đức) sử dụng bộ kit SYBR Green FastStart (Roche, Basel, Thụy Sĩ). Các chu kỳ PCR như sau:

1 chu kỳ ở 50°C trong 2 phút
1 chu kỳ ở 95°C trong 10 phút
40 chu kỳ ở 95°C trong 15 giây và ở 60 ° C trong 1 phút.

Biểu thức tương đối được tính bằng phương pháp 2 −ΔΔCt .

Bảng 1 . Trình tự mồi được sử dụng cho qRT-PCR.

Gene	Sơn lót	Sơn lót ngược
NQO1	GCGAGAAGAGCCCTGATTGTACTG	AGCCTCTACAGCAGCCTCCTTC
HMOX1	ACCGCCTTCCTGCTCAACATTG	CTCTGACGAAGTGACGCCATCTG
Keap1	TGGTCGCCCTGTGCCTCTATG	ATGCCACTCGTCCCGCTCTG
Nrf2	AAGCACAGCCAGCACATTCTCC	TGACCAGGACTCACGGGAACTTC
β-actin	GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG	ATGCCACAGGATTCCATACC

1.9. Phân tích sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC)

SF và polyphenol được phân lập từ chiết xuất bông cải xanh bằng phương pháp của Wu et al (2014) thực hiện trên thiết bị TBE 300A (Tauto Biotech, Thượng Hải, Trung Quốc), được trang bị ba cuộn dây (đường kính trong của ống 1,8 mm), và thể tích cuối cùng của pha lỏng là 300 mL. Các điều kiện của HSCCC như sau: tốc độ quay là 1000 vòng / phút, tốc độ dòng chảy là 1,5 mL / phút, thể tích nạp là 5 mL, bước sóng phát hiện là 241 nm, tỷ lệ ete dầu mỏ: etyl axetat: metanol: nước là 1: 4 : 1: 4 (v / v / v / v). Các phân đoạn sau khi rửa giải được thu thập cứ sau 5 phút một lần (tổng số 240 phút). Hàm lượng polyphenol và Sulforaphane trong mỗi ống được xác định theo phương pháp của Migues và cộng sự (2020), Han và Row (2011), tương ứng. Các phân đoạn tinh khiết tương tự được gộp lại với nhau để phân tích thêm.

1.10. Phân tích thống kê

Các thử nghiệm được tiến hành với ba lần lặp lại. Độ lệch chuẩn của dữ liệu được xác định bằng phần mềm Origin (phiên bản 5.0), phần mềm Excel và Microsoft (phiên bản 2016). SPSS (phiên bản 17.0) được sử dụng để có ý nghĩa thống kê giữa các cấp.

2. Kết quả

2.1. Ảnh hưởng của chiết xuất bông cải xanh và SF đối với T-AOC và hoạt động của NQO1, CAT và MDA trong tế bào B16

Như thể hiện trong Bảng 2, tế bào B16 được xử lý trước bằng chiết xuất bông cải xanh hoặc SF và sau đó được xử lý bằng H2 O2 làm tăng đáng kể T-AOC so với nhóm mô hình (P<0,05). T-AOC và các hoạt động của NQO1 trong tế bào B16 cũng tăng đáng kể với sự gia tăng của chất chiết xuất từ bông cải xanh và nồng độ SF. Khi nồng độ của chất chiết xuất từ bông cải xanh và SF là 10 μM, T-AOC, NQO1 và CAT trong tế bào B16 có hoạt tính cao nhất. Các chất chiết xuất từ bông cải xanh (5 và 10 μM) và SF (10 μM) làm giảm đáng kể hàm lượng MDA trong phần nổi của tế bào và quá trình peroxy hóa lipid. Ngoài ra, nhóm chiết xuất từ bông cải xanh tốt hơn nhóm SF trong việc cải thiện T-AOC và hoạt động của enzym chống oxy hóa (đặc biệt là NQO1) và giảm hàm lượng MDA.

Bảng 2. Ảnh hưởng của chiết xuất bông cải xanh và SF đối với T-AOC và các hoạt động của NQO1 , CAT và MDA

Các nhóm	T-AOC (mM / g)	NQO1 (nM / phút / mg)	CAT (U / mg)	MDA (nM / mL)
Trống	2,11 ± 0,39 b	12,41 ± 2,70 a	2,62 ± 0,45 b	0,81 ± 0,16 c
Mẫu	1,18 ± 0,30 a	12,00 ± 4,01 a	1,31 ± 0,39 a	1,22 ± 0,21 e
SF-2,5 μM	2,42 ± 0,05 c	19,40 ± 3,80 b	2,43 ± 0,14 bc	1,02 ± 0,21 e
SF-5 μM	2,62 ± 0,10 c	36,72 ± 6,40 ngày	2,53 ± 0,32 bc	0,89 ± 0,13 e
SF-10 μM	3,65 ± 0,06 ngày	46,00 ± 6,10 ngày	2,65 ± 0,03 c	0,86 ± 0,04 ngày
BE-2,5 μM	1,91 ± 0,17 b	24,91 ± 6,60 c	2,02 ± 0,51 b	0,98 ± 0,14 e
BE-5 μM	3,36 ± 0,09 ngày	24,80 ± 4,30 c	2,54 ± 0,27 bc	0,76 ± 0,07 b
BE-10 μM	6,67 ± 0,31 e	62,61 ± 3,60 e	2,82 ± 0,45 c	0,66 ± 0,05 a

BE: chiết xuất từ bông cải xanh. Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± SD (n = 3). a − e Các giá trị trong cùng một cột với các ký tự trên khác nhau là khác nhau có ý nghĩa ( P <0,05).

2.2. Ảnh hưởng của chiết xuất bông cải xanh và SF lên mức protein NQO1, HMOX-1, Keap1 và Nrf2 trong tế bào B16

Kết quả Western blot cho thấy mức protein NQO1, HMOX-1, Keap1 và Nrf2 trong nhóm mô hình đã giảm so với nhóm trắng (Hình 1). Sau khi xử lý bằng chiết xuất bông cải xanh và SF, mức độ biểu hiện của các protein này cao hơn đáng kể so với trong nhóm mô hình. Mức độ biểu hiện của các protein này cũng dần dần tăng lên với sự gia tăng của các chất chiết xuất từ bông cải xanh và SF và cho thấy mối quan hệ phụ thuộc vào liều lượng đáng kể. Hơn nữa, hàm lượng protein NQO1, HMOX-1, Keap1 và Nrf2 trong nhóm chiết xuất từ bông cải xanh cao hơn so với nhóm SF ở cùng nồng độ.

Hình 1 . Tác động của chiết xuất bông cải xanh và SF đối với sự biểu hiện của các protein NQO1 (B), HMOX-1 (C), Keap1 (D) và Nrf2 (E) trong tế bào B16. Các tế bào được xử lý trước bằng chất chiết xuất từ bông cải xanh hoặc SF trong 24 giờ và sau đó được xử lý bằng H 2 O 2 trong 2 giờ. Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± SD (n = 3). a − e Các giá trị với các ký tự trên khác nhau là khác nhau có ý nghĩa ( P <0,05).

2.3. Ảnh hưởng của chiết xuất bông cải xanh và SF lên sự biểu hiện mRNA của NQO1, HMOX-1, Keap1 và Nrf2 trong tế bào B16

So với nhóm mô hình, xử lý chiết xuất bông cải xanh và SF làm tăng mức độ biểu hiện của các gen NQO1, HMOX-1 và Keap1 và cho thấy mối quan hệ phụ thuộc vào liều lượng đáng kể (Hình 2). Đặc biệt, mức độ biểu hiện của gen NQO1 và HMOX-1 trong chiết xuất bông cải xanh và nhóm SF cao hơn đáng kể so với nhóm mô hình. Khi nồng độ cao của chiết xuất bông cải xanh (10 μM) và SF (5 và 10 μM) được thêm vào, mức độ biểu hiện của gen Keap1 cao hơn đáng kể so với nhóm mô hình. Gen Nrf2 được kích hoạt đáng kể khi các tế bào được xử lý bằng chất chiết xuất từ bông cải xanh (5 và 10 μM) ( P <0,05). Ngoài ra, mức độ biểu hiện của các gen NQO1, HMOX-1 và Nrf2 trong nhóm chiết xuất từ bông cải xanh cao hơn so với nhóm SF ở cùng nồng độ, phù hợp với kết quả của các hoạt động và phân tích Western blot.

Hình 2 . Ảnh hưởng của chiết xuất bông cải xanh và SF lên sự biểu hiện của mRNA NQO1 (A), HMOX-1 (B), Keap1 (C) và Nrf2 (D) trong tế bào B16. Các tế bào được xử lý trước bằng chất chiết xuất từ bông cải xanh hoặc SF trong 24 giờ và sau đó được xử lý bằng H 2 O 2 trong 2 giờ. Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± SD (n = 3). a-f Các giá trị với các chỉ số siêu khác nhau là khác nhau có ý nghĩa ( P <0,05).

2.4. Tách và tinh chế các thành phần hoạt tính sinh học trong chiết xuất bông cải xanh

SF và các thành phần khác được tách ra từ chiết xuất bông cải xanh bởi HSCCC và được trình bày trong Hình 3. Thời gian lưu của 4 pic lần lượt là

50–80 phút (F1)
125–145 phút (F2)
150–200 phút (F3)
205–235 phút (F4)

Nội dung của polyphenol trong bộ sưu tập HSCCC được thể hiện trong Hình 3B. Nó được chỉ ra rằng hầu như không có polyphenol trong F4 (205–235 phút). Nội dung của ITC trong F1, F2, F3 và F4 được thể hiện trong Bảng 3. Nội dung của ITC cao nhất ở F4 và thấp nhất ở F1. F1 được xác định là polyphenol và F4 là SF bằng cách so sánh với các tiêu chuẩn (dữ liệu không được hiển thị).

Hình 3 . Sắc ký đồ HSCCC của chất chiết xuất từ bông cải xanh (A) và xác định polyphenol (B)

Bảng 3. Nồng độ ITC trong các mẫu HSCCC khác nhau của chiết xuất bông cải xanh từ Hình 3A.

Đỉnh	Thời gian lưu (tối thiểu)	ITC (μM)
F1	50–80	118,81 ± 25,12
F2	125–145	71,24 ± 13,20
F3	150–200	2005,28 ± 341,60
F4	205–235	18969,39 ± 2400,54

Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± SD (n = 3).

2.5. Ảnh hưởng của polyphenol và SF tinh khiết lên T-AOC và các hoạt động của NQO1

Ảnh hưởng của polyphenol và SF tinh khiết (PSF) đối với hoạt động của T-AOC và NQO1 được thể hiện trong Bảng 4. Polyphenol (25 và 50 μM) và PSF (2,5, 5 và 10 μM) làm tăng đáng kể hoạt động của T-AOC và NQO1 (P <0,05). Hoạt động của T-AOC và NQO1 được tăng dần khi tăng nồng độ polyphenol và PSF. PSF cho thấy mức độ cao hơn trong việc tăng hoạt động T-AOC và NQO1 so với polyphenol.

Bảng 4 . Ảnh hưởng của polyphenol và PSF đến T-AOC và các hoạt động của NQO1

Các nhóm	T-AOC (mM / g)	NQO1 (nM / phút / mg)
Trống	2,11 ± 0,39 b	12,41 ± 2,70 a
Người mẫu	1,18 ± 0,30 a	12,00 ± 4,01 a
Polyphenol-12,5	1,02 ± 0,03 a	11,92 ± 2,50 a
Polyphenol-25	2,30 ± 0,08 b	16,30 ± 2,10 b
Polyphenol-50	5,87 ± 0,24 ngày	21,91 ± 2,91 c
PSF-2.5	2,16 ± 0,12 b	21,51 ± 2,74 c
PSF-5	2,32 ± 0,16 b	23,17 ± 2,42 c
PSF-10	2,94 ± 0,10 c	24,63 ± 1,87 c

Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± SD (n = 3). a − d Các giá trị trong cùng một cột với các ký tự trên khác nhau là khác nhau có ý nghĩa ( P <0,05).

3. Kết luận

Nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng chiết xuất bông cải xanh và SF làm giảm bớt căng thẳng oxy hóa trong tế bào B16 gây ra H2 O2, cũng như tăng cường hoạt động của các enzym chống oxy hóa. Tác dụng chống oxy hóa của chất chiết xuất từ bông cải xanh và SF có liên quan đến việc tăng cường biểu hiện gen chống oxy hóa Giai đoạn 2 thông qua con đường tín hiệu Nrf2 / Keap1, và chất chiết xuất từ bông cải xanh tốt hơn SF trong việc cải thiện hoạt động của enzym chống oxy hóa, vì cả polyphenol và SF trong chất chiết xuất từ bông cải xanh có thể tăng đáng kể Hoạt động của T-AOC và NQO1. Do đó, tác dụng chống oxy hóa hiệp đồng của polyphenol và SF trên H2 O2 tế bào B16 cảm ứng nên được khám phá ở nhiều nghiên cứu chuyên sâu hơn trong tương lai.

4. Các chủ đề liên quan

Dưới đây là một số bài viết về các chủ đề nghiên cứu có liên quan đến hoạt chất Sulforaphane và công dụng của chúng:

5. Tham vấn chuyên môn

Bác sĩ
Nguồn tham khảo: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1756464621004825