Tổng quan
Sulforaphane là một thành phần được tìm thấy trong nhiều loại rau họ cải, bao gồm bắp cải, cải bruxen, súp lơ trắng, bông cải xanh, bông cải xanh Trung Quốc, mầm bông cải xanh, bông cải xanh, cải ngọt, cải thìa, su hào, mù tạt, củ cải, cải xoăn và củ cải. Nó là một hợp chất organosulfur tự nhiên có khả năng bảo vệ thần kinh, chống vi khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa, chống chất gây ung thư, chống lão hóa và chống lại bệnh tiểu đường. Hợp chất này cũng được biết đến với chức năng như một chất ngăn ngừa hóa chất trong các bệnh thoái hóa thần kinh và tim mạch. Tuy nhiên, vai trò bảo vệ của Sulforaphane chống lại tổn thương hạt nhân và ty thể do kim loại cadmium gây ra vẫn chưa rõ ràng.
Cadmium là một trong những kim loại nặng độc hại được sử dụng trong các ứng dụng khác nhau. Theo Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), Cd được phân loại là chất gây ung thư nhóm I, và thời gian bán hủy dài của cadmium dẫn đến tích tụ quá nhiều trong cơ thể người và có tác dụng độc hại. Các nghiên cứu in vitro và in vivo trước đó cho thấy rõ ràng rằng chất Phytochemical làm giảm bớt độc tính do Cd gây ra; tuy nhiên, cơ chế mà Sulforaphane bảo vệ chống lại các tác động bất lợi của Cd trong tế bào gốc trung mô của người (hMSCs) trong bối cảnh các kiểu biểu hiện gen vẫn chưa được biết rõ. Để khám phá điều này, chúng tôi đã nghiên cứu vai trò bảo vệ của Sulforaphane chống lại độc tính do Cd gây ra ở cấp độ phân tử bằng cách sử dụng hMSCs làm mô hình in vitro, vì những tế bào này có tiềm năng biệt hóa thành các dòng khác nhau bao gồm nguyên bào xương , tế bào mỡ , tế bào cơ, tế bào thần kinh và tế bào chondrocytes.
1. Nguyên liệu và phương pháp
1.1. Bảo trì hMSCs
hMSCs được lấy từ Đơn vị Tế bào gốc tại Đại học Y khoa, Đại học King Saud, Ả Rập Xê Út. Các tế bào được nuôi cấy trong bình nuôi cấy mô T25 và T75 có chứa môi trường Eagle’s cải tiến của Dulbecco (DMEM) được bổ sung với 10% huyết thanh bò thai và kháng sinh (100 đơn vị / mL streptomycin và 10 đơn vị / mL penicilin). Các tế bào được ủ trong môi trường làm ẩm với 5% CO2được duy trì ở 37 ° C.
1.2. Thử nghiệm khả năng sống của tế bào
Ảnh hưởng của việc xử lý Cd, Sulforaphane và Cd + Sulforaphane đối với khả năng tồn tại của hMSCs được phân tích bằng xét nghiệm MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide). Phạm vi liều logarit đã được tối ưu hóa và liều bán logarit được sử dụng trong nghiên cứu này. Dung dịch gốc Sulforaphane được chuẩn bị bằng dimethyl sulfoxide (DMSO). Dung dịch làm việc được chuẩn bị bằng cách sử dụng môi trường nuôi cấy tế bào. CdCl 2dung dịch làm việc được chuẩn bị với môi trường nuôi cấy tế bào. Các hMSC được gieo với mật độ 10.000 tế bào / giếng trong các đĩa 96 giếng. Sau 24 giờ ủ (hợp lưu 80–90%), các tế bào nuôi cấy được xử lý với các nồng độ Cd khác nhau (0, 10, 20 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 μM) và Sulforaphane (0, 10, 20 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 μM) trong 48 giờ.
Sau 48 giờ, khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng cách thêm 20 μL dung dịch MTT vào mỗi giếng ở nồng độ 5 mg / mL trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS). Sau khi ủ qua đêm, các tinh thể formazan thu được được hòa tan trong DMSO (100%), và các đĩa được quét trong máy đọc vi tấm ở bước sóng 570 nm. Dữ liệu thu được được sử dụng để tính toán IC 25, IC 50và IC 75 giá trị cho Cd. Hơn nữa, chúng tôi đã chọn liều Cd tối ưu (tức là IC 25, IC 50 và IC 75) cho các nghiên cứu sâu hơn.
Tiếp theo, các tổ hợp Cd-Sulforaphane (Cd-IC 25 + sulf-20/40/60/80/100 μM, Cd-IC 50 + sulf-20/40/60/80/100 μM và Cd-IC 75 + sulf-20/40/60/80/100 μM) được sử dụng để xử lý hMSCs trong 48 giờ. Sau khi phơi nhiễm, dữ liệu về khả năng tồn tại của tế bào đã được thu thập. Thử nghiệm khả năng sống sót của tế bào được thực hiện ba lần cho mỗi liều.
1.3. Nhuộm màu cam acridine / Ethidium bromide
Các tế bào được mạ với mật độ 50.000 tế bào / giếng trong các đĩa 24 giếng. Sau 24 giờ, các tế bào đạt 80–90% hợp lưu. Sau đó, các tế bào được tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của Cd (IC 25 , IC 50 và IC 75 ), Sulforaphane (20 μM, 40 μM và 80 μM), và Cd-Sulforaphane kết hợp (Cd-IC 25 + sulf-40 μM , Cd-IC 50 + sulf-40 μM và Cd-IC 75 + sulf-40 μM) trong 48 giờ. Sau 48 giờ tiếp xúc, các tế bào được nhuộm bằng nhuộm kép acridine cam và ethidium bromide (AO / EB) với tỷ lệ 1: 1 (20 μg / mL), và những thay đổi trong nhân và tế bào chất [ 27 ] được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang (Carl Zeiss, Jena, Đức). Nhuộm AO / EB được thực hiện ba lần cho mỗi liều.
1.4. Hoechst 33342 nhuộm
Các tế bào được phát triển đến 80–90% hợp lưu trong các đĩa 24 giếng và sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau của Cd (IC 25 và IC 50 ), Sulforaphane (40 μM và 80 μM), hoặc đồng xử lý Cd-Sulforaphane (Cd -IC 25 + sulf-40 μM và Cd-IC 50 + sulf-40 μM) trong 48 giờ. Sau 48 giờ xử lý, các tế bào được nhuộm bằng dung dịch Hoechst 33342 1 μM và bảo quản trong bóng tối trong 10 phút. Sau khi nhuộm, các tế bào được rửa bằng PBS, và những thay đổi ở nhân được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Quá trình nhuộm Hoechst được thực hiện trong ba lần cho mỗi liều.
1.5. Nhuộm màu LysoRed
Các tế bào được tiếp xúc với IC 25 và IC 50 liều Cd, 40 μM và 80 μM Sulforaphane, hoặc đồng xử lý Cd-Sulforaphane (Cd-IC 25 + sulf-40 μM và Cd-IC 50 + sulf-40 μM ) trong 48 giờ. Một bộ nhuộm lysosome được mua từ Abcam, Dammam, Vương quốc Ả Rập Saudi. Theo hướng dẫn sử dụng, các tế bào được nhuộm bằng chất chỉ thị LysoRed và ủ ở 37 ° C trong 30 phút. Sau đó, các tế bào được rửa sạch và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Quá trình nhuộm LysoRed được thực hiện trong ba lần cho mỗi liều.
1.6. Phân tích điện thế màng ty thể (MMP)
hMSCs được nuôi trong các đĩa 24 giếng và các tế bào được tiếp xúc với Cd (IC 25 và IC 50 ), Sulforaphane (40 μM và 80 μM), hoặc đồng xử lý Cd-Sulforaphane (Cd-IC 25 + sulf-40 μM và Cd-IC 50 + sulf-40 μM) trong 48 giờ. Sau 48 giờ phơi nhiễm, MMP của hMSCs được đánh giá bằng phương pháp nhuộm JC-1. Tế bào được nhuộm với 10 μL JC-1 (200 μM) mỗi giếng và sau đó rửa sạch bằng PBS. Đĩa được ủ trong bóng tối trong 30 phút ở 37 ° C. Sau khi nhuộm, các tế bào được kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nhuộm JC-1 được thực hiện trong ba lần cho mỗi liều.
1.7. Phân tích biểu hiện gen định lượng
Để phân tích biểu hiện gen, các hMSC được nuôi cấy và tiếp xúc với Cd, Sulforaphane, hoặc đồng xử lý Cd-Sulforaphane trong 48 giờ. Sau 48 giờ điều trị, kit Fastlane® Cell cDNA (QIAGEN, Đức) được sử dụng để tổng hợp cDNA từ các tế bào. Mức mRNA của các gen mục tiêu (CYCS , MDM2 , MT2 A, ATM, HMOX1 , XRCC1 , POR , TNFRSF1A và TNFSF10) được khảo sát bằng cách sử dụng GAPDH làm gen tham chiếu (Bảng 1). Hỗn hợp phản ứng 25 μL được chuẩn bị với 12,5 μL hỗn hợp chính, 2 μL mẫu cDNA (100 μg), 2 μL xét nghiệm mồi (10 ×) và 4 μL nước không có RNase trong mỗi giếng 96- tấm PCR tốt, và hỗn hợp phản ứng được thực hiện Real time-PCR trong 40 chu kỳ như phương pháp đã mô tả trước đây.
Dữ liệu thu được được phân tích bằng phương pháp ngưỡng so sánh (Ct). Biểu hiện gen mục tiêu của các tế bào được xử lý được so sánh với biểu hiện của gen đối chứng. Mức độ biểu hiện gen mục tiêu được tính toán bằng một phương pháp được mô tả trước đây và chuẩn hóa thành biểu hiện của gen tham chiếu bên trong, GAPDH. Các công thức được sử dụng để xác định tỷ lệ biểu hiện của gen tham chiếu với các gen mục tiêu, cũng như các mức biểu hiện tương đối, như sau:
- ΔCt = Ct (gen mục tiêu) – Ct (GAPDH)
- ΔΔCt = ΔCt (Đã xử lý) – ΔCt (Điều khiển)
Các giá trị này được sử dụng để vẽ biểu đồ của các gen mục tiêu bằng cách sử dụng biểu thức 2 −ΔΔCt .
Bảng 1 . Xét nghiệm mồi QuantiTect
| Gene | Cat. No | Số gia nhập | UniGene |
| CYCS (Cytochrome c, soma) | QT01672342 | NM_018947 | Hs.437060 |
| MDM2 (E3 ubiquitin-protein ligase) | QT01004276 | NM_006880 | Hs.733536 |
| MT2A (Metallothionein 2 A) | QT02317819 | NM_005953 | Hs.534330 |
| ATM (ATM serine / threonine kinase) | QT01671992 | NM_000051 | Hs.367437 |
| HMOX1 (Heme oxygenase 1) | QT00092645 | NM_002133 | Hs.517581 |
| XRCC1 (protein bổ sung chéo sửa chữa tia X 1) | QT00016688 | NM_006297 | Hs.98493 |
| POR (Cytochrome P450 Oxidoreductase) | QT00045339 | NM_000941 | Hs.354056 |
| TNFRSF1A (Siêu họ thụ thể yếu tố hoại tử khối u thành viên 1 A) | QT00216993 | NM_001065 | Hs.279594 |
| TNFSF10 (Phối tử yếu tố hoại tử khối u thành viên siêu họ 10) | QT00079212 | NM_003810 | Hs.478275 |
| GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) | QT01192646 | NM_002046 | Hs.544577 |
1.8. Phân tích thống kê
Dữ liệu thu được được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD), ANOVA và t-test dữ liệu được tính toán bằng SPSS (Tập đoàn IBM, Hoa Kỳ) và Microsoft Office Excel. Dữ liệu kết hợp Cd-Sulforaphane được phân tích bằng phần mềm CalcuSyn (Biosoft, USA). Giá trị p ≤ 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
2. Các kết quả của nghiên cứu
2.1. Khả năng di động
Ảnh hưởng của Cd đơn lẻ, Sulforaphane đơn lẻ và sự kết hợp Cd-Sulforaphane đối với khả năng sống sót của hMSC đã được phân tích bằng xét nghiệm MTT và được trình bày trong Hình 1. Kết quả chứng minh rằng các ion Cd làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của hMSCs sau 48 giờ tiếp xúc. Điều thú vị là 60 μM Cd làm giảm khả năng tồn tại của hMSC khoảng 90% (Hình 1). Từ Hình 1, chúng tôi tính toán các giá trị IC25, IC50và IC75cho Cd lần lượt là 6, 13,65 và 39,8 μM. Kết quả chỉ ra rõ ràng rằng các ion Cd gây ra chết tế bào trong hMSCs theo cách phụ thuộc vào liều lượng.
Hình 1. Ảnh hưởng của ion Cd đến khả năng tồn tại của tế bào gốc trung mô của người sau 48 giờ. (a) Đồ thị hiệu ứng trung vị và (b) đường cong hiệu ứng liều lượng được tính toán bằng phần mềm Calcusyn. (c) Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của các ion Cd đến khả năng tồn tại của tế bào . Dữ liệu đại diện cho giá trị trung bình ± SD của ba thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần. ٭ p <0,05, ٭٭ p <0,01 so với đối chứng.
Chúng tôi cũng đánh giá tác dụng gây độc tế bào của Sulforaphane (10–100 μM; Hình 2). Sulforaphane không làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của hMSCs ở nồng độ lên đến 100 μM. Do đó, chúng tôi đã đánh giá tác động của Sulforaphane đối với ngộ độc Cd. Tế bào được xử lý với các nồng độ khác nhau của sự kết hợp Cd-Sulforaphane (Cd-IC 25 + sulf-20/40/60/80/100 μM, Cd-IC 50 + sulf-20/40/60/80/100 μM, và Cd-IC 75 + sulf-20/40/60/80/100 μM) trong 48 giờ và kết quả được hiển thị trong Hình 3 .
Đồng xử lý với IC 50 và IC 75nồng độ Cd và Sulforaphane cho thấy sự phục hồi đáng kể của hMSCs từ quá trình chết của tế bào. Khoảng 15–30% tế bào được phục hồi sau khi tế bào chết trong điều kiện đồng xử lý với Cd-IC 75 và các nồng độ Sulforaphane khác nhau (20, 40, 60, 80 và 100 μM). Điều thú vị là sự kết hợp IC 50 -Cd + Sulforaphane / 60/80/100 μM phục hồi khoảng 7–15% tế bào khỏi quá trình chết của tế bào. Những kết quả này cho thấy rằng Sulforaphane làm giảm độc tính do Cd gây ra sau 48 giờ tiếp xúc trong hMSCs.
Hình 2. Ảnh hưởng của sulforaphane đến khả năng tồn tại của tế bào gốc trung mô của người sau 48 giờ. (a) Đồ thị hiệu ứng trung vị và (b) đường cong hiệu ứng liều lượng được tính toán bằng phần mềm Calcusyn. (c) Ảnh hưởng của các nồng độ sulforaphane khác nhau đến khả năng sống của tế bào . Dữ liệu đại diện cho giá trị trung bình ± SD của ba thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần.
Hình 3. Ảnh hưởng của đồng điều trị Cd-sulforaphane đến khả năng tồn tại của tế bào gốc trung mô của người sau 48 giờ. Các tế bào được tiếp xúc với các kết hợp khác nhau của sulforaphane và Cd ((Cd-IC 25 + sulf-20/40/60/80/100 μM; Cd-IC 50 + sulf-20/40/60/80/100 μM, và Cd-IC 75 + sulf-20/40/60/80/100 μM). ٭ p <0,05, ٭٭ p <0,01 so với đối chứng.
2.2. Hình thái hạt nhân
Sự thay đổi hình thái hạt nhân được đánh giá bằng cách sử dụng nhuộm kép AO / EB và nhuộm Hoechst. Hình 4 mô tả kết quả nhuộm AO / EB của hMSCs chưa được xử lý và Cd, Sulforaphane, và Cd-Sulforaphane được xử lý kết hợp trong 48 giờ. Hình ảnh hiển vi nhuộm AO / EB chỉ ra rằng các ion Cd gây ra cái chết của tế bào apoptotic và hoại tử trong hMSCs. Tuy nhiên, điều trị bằng Sulforaphane không gây ra bất kỳ thay đổi nào về hình thái hạt nhân và tế bào chất của hMSCs, điều này chỉ ra rõ ràng rằng Sulforaphane là một chất tương hợp sinh học. Kết quả đồng điều trị Cd-Sulforaphane gợi ý rằng sự chết tế bào hoại tử do Cd bị ức chế bởi điều trị bằng Sulforaphane và việc đồng điều trị Cd-Sulforaphane cải thiện tình trạng ngộ độc Cd trong hMSCs.
Hình 4. Nhuộm AO / EB tế bào gốc trung mô của người được xử lý bằng đồng xử lý cadmium, sulforaphane và Cd-sulforaphane để xác định các thay đổi hình thái hạt nhân sau 48 giờ. Các tế bào được xử lý với các liều khác nhau của Cd (IC 25, IC 50 và IC 75), Sulforaphane (20, 40 và 80 μM), hoặc đồng điều trị với sulforaphane và Cd (Sulf-40 μM + Cd-IC 25 ; Sulf-40 μM + Cd-IC 50 và Sulf-40 μM + Cd-IC 75).
Hình ảnh hiển vi của nhuộm Hoechst được thể hiện trong Hình 5. Các hình ảnh hiển vi chứng minh rằng các tế bào được xử lý bằng Cd cho thấy nhân cô đặc, trong khi các tế bào không được điều trị không có sự thay đổi về hình thái nhân. Những kết quả này chỉ ra rõ ràng rằng các tế bào kiểm soát là khỏe mạnh và các tế bào được xử lý với Cd bị hư hỏng. Kết quả nhuộm Hoechst phù hợp với kết quả nhuộm AO / EB. Những kết quả này chỉ ra rõ ràng rằng Sulforaphane điều chỉnh mô hình độc tính của kim loại Cadmium trong hMSCs.
Hình 5. Nhuộm hoechst tế bào gốc trung mô của người được xử lý bằng đồng xử lý cadmium, sulforaphane và Cd-sulforaphane để xác định những thay đổi về hình thái hạt nhân sau 48 giờ. Các tế bào được xử lý với các liều khác nhau của Cd (IC 50 và IC 75 ), sulforaphane (40, và 80 μM), đồng thời xử lý sulforaphane và Cd (Sulf-40 μM + Cd-IC 50 và Sulf-40 μM + Cd-IC 75 ). Mũi tên đỏ chỉ các hạt nhân ngưng tụ.
2.3. Nhuộm màu LysoRed
Lysosome tham gia vào quá trình loại bỏ các vật chất không mong muốn bên ngoài bằng cách tiêu hóa. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc điều trị Cd, Sulforaphane và Cd-Sulforaphane trên lysosome bằng phương pháp nhuộm LysoRed (Hình 6). Các tế bào được xử lý Cd có cấu trúc được axit hóa hoàn toàn với tế bào chất bị thu gọn. Ngược lại, các phương pháp điều trị bằng Sulforaphane và Cd-Sulforaphane đã phục hồi làm giảm bớt tế bào chất bị axit hóa trong một số lượng đáng kể tế bào.
Hình 6. Nhuộm LysoRed đối với tế bào gốc trung mô của người được xử lý bằng đồng xử lý cadmium, sulforaphane và Cd-sulforaphane trong 48 giờ. Các tế bào được xử lý với các liều khác nhau của Cd (IC 50 và IC 75 ), sulforaphane (40, và 80 μM), hoặc đồng xử lý với sulforaphane và Cd (Sulf-40 μM + Cd-IC 50 và Sulf-40 μM + Cd-IC 75).
2.4. MMP
Rối loạn điều hòa MMP là một chỉ số quan trọng của sức khỏe tế bào. Sau 48 giờ tiếp xúc với Cd, Sulforaphane hoặc Cd-Sulforaphane, MMP của hMSCs được phân tích bằng phương pháp nhuộm JC-1 (Hình 7). Hình ảnh hiển vi huỳnh quang được thể hiện trong Hình 7. Hình ảnh của các tế bào được xử lý Cd cho thấy các tế bào huỳnh quang màu xanh lục, và tỷ lệ tế bào phát huỳnh quang tăng lên khi nồng độ ion Cd tăng lên. Những kết quả này chỉ ra rằng Cd làm giảm MMP một cách phụ thuộc vào liều lượng. Các tế bào được xử lý bằng Sulforaphane có ty thể khỏe mạnh và không có thay đổi nào được quan sát thấy khi so sánh với đối chứng. Điều trị Cd-Sulforaphane làm giảm sự giảm MMP. Kết quả của chúng tôi cho thấy rõ ràng rằng Sulforaphane làm thay đổi mô hình độc tính Cd trong hMSCs Hình 7 .
Hình 7. Ảnh hưởng của điều trị cadmium, sulforaphane và Cd-sulforaphane trên tiềm năng màng ty thể của tế bào gốc trung mô của người sau 48 giờ. Phát huỳnh quang màu đỏ cam của chất dimer JC-1 được quan sát thấy ở các tế bào có điện thế màng ty thể cao, trong khi huỳnh quang màu xanh lục của JC-monomer phổ biến ở các vùng tế bào có điện thế màng ty thể thấp. Cd gây ra sự vô tổ chức của ty thể trong hMSCs.
2.5. Biểu hiện gen
Hiệu quả của việc điều trị Cd, Sulforaphane và Cd-Sulforaphane đối với sự biểu hiện gen hMSC được đánh giá bằng cách sử dụng RT-PCR Hình 8. Các gen được phân tích là CYCS , MDM2 , MT2 A, ATM , HMOX1 , XRCC1 , POR , TNFRSF1A và TNFSF10. CYCS mã hóa cytochrome C tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử trong ti thể và trong quá trình apoptotic.
Chúng tôi quan sát thấy rằng mức độ biểu hiện CYCS tăng lên đáng kể trong Cd-IC 50 + sulf và Cd-IC 75+ tế bào được xử lý bằng sulf so sánh với các tế bào được điều trị bằng Cd và Sulforaphane đơn thuần. Khi đồng điều trị Cd-Sulforaphane gây ra cái chết của tế bào thông qua quá trình apoptosis, chúng tôi đã nghiên cứu vai trò của MDM2 trong quá trình này. MDM2 là một chất ức chế p53 , nơi nó liên kết với protein mã hóa p53 để ngăn chặn sự biểu hiện của nó. Biểu hiện gen MDM2 được điều chỉnh đáng kể sau khi đồng điều trị Cd-Sulforaphane, nhưng không có thay đổi đáng kể nào được quan sát thấy ở các tế bào được điều trị chỉ với Cd hoặc Sulforaphane. Mức độ biểu hiện gen Metallothionein 2 A ( MT2 A ) cũng không bị thay đổi đáng kể.
Đồng điều trị Cd-Sulforaphane làm tăng mức độ biểu hiện gen của ATM(ATM serine / threonine kinase) và XRCC1 (protein bổ sung chéo sửa chữa tia X 1) để giảm tổn thương DNA. Hơn nữa, mô hình biểu hiện gen POR, TNFRSF1A và TNFSF10 được điều chỉnh đáng kể bằng cách đồng điều trị Cd-Sulforaphane trong hMSC so với những gì được quan sát thấy sau khi điều trị chỉ với Cd hoặc Sulforaphane. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rõ ràng rằng việc đồng xử lý Cd-Sulforaphane trong hMSCs trong 48 giờ làm thay đổi đáng kể kiểu biểu hiện gen.
Hình 8. Phân tích biểu hiện gen của tế bào gốc trung mô của người được điều trị bằng Cd, sulforaphane và Cd-sulforaphane trong 48 giờ. Các thay đổi về mức độ biểu hiện được thể hiện dưới dạng thay đổi lần lượt (tức là tỷ lệ gen đích so với gen tham chiếu, GAPDH) sau khi tiếp xúc với đồng điều trị Cd, sulforaphane và Cd-sulforaphane trong 48 giờ. Dữ liệu đại diện cho giá trị trung bình ± SD của ba thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần. ٭ p <0,05, ٭٭ p <0,01 so với đối chứng.
3. Kết luận
Trong điều tra hiện tại, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của Sulforaphane đối với độc tính của kim loại Cadmium trong hMSCs. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho rằng Sulforaphane làm giảm thiểu kiểu nhiễm độc Cd trong tế bào bạch huyết ngoại vi và bạch cầu đơn nhân của người; tuy nhiên, ảnh hưởng của Sulforaphane đối với độc tính Cd trong hMSCs vẫn chưa được biết rõ. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các chất hóa thực vật trong chế độ ăn uống như axit sinapic, taxifolin, chiết xuất hành tây, chiết xuất tỏi, quercetin, betaine và naringenin làm giảm độc tính Cd. Sau 48 giờ phơi nhiễm Cd, hMSCs biểu hiện giảm khả năng tồn tại phụ thuộc vào liều lượng có thể được giảm bớt bằng cách điều trị bằng Sulforaphane.
Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi về khả năng tồn tại của tế bào đã chỉ ra rõ ràng rằng Sulforaphane đã bảo vệ đáng kể khả năng tồn tại của hMSCs khỏi độc tính Cd. Các kết quả này khẳng định rõ ràng rằng Sulforaphane là một hợp chất tương hợp sinh học rất thích hợp cho các ứng dụng sinh học.
Phân tích hình thái hạt nhân đã chứng minh rằng Cd gây ra cái chết hoại tử và chết theo mô trong hMSCs theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Các nghiên cứu trước đó đã chứng minh rằng Cd gây ra cái chết apoptotic ở các tế bào lympho ngoại vi của con người và bạch cầu đơn nhân, tế bào mầm tuyến sinh dục phôi thai người, và nguyên bào xương sơ cấp. Các thay đổi cấu trúc hạt nhân do Cd gây ra đã giảm trong các hMSC được xử lý bằng Cd-Sulforaphane, cho thấy rằng Sulforaphane điều chỉnh mô hình độc tính Cd. Tương tự, Sulforaphane làm giảm độc tính của Cd trong tế bào lympho máu ngoại vi và bạch cầu đơn nhân.
Ti thể là một bào quan quan trọng của tế bào, hoạt động như một ngôi nhà năng lượng của tế bào, và chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe của tế bào. Giảm MMP dẫn đến rối loạn chức năng ty thể, có liên quan đến một số bệnh bao gồm các bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường và các bệnh thoái hóa thần kinh. Sau 48 giờ phơi nhiễm, Cd làm giảm đáng kể MMP trong hMSCs. Việc đồng điều trị Cd và Sulforaphane đã bảo vệ các tế bào khỏi sự giảm MMP do Cd gây ra. Kết quả của chúng tôi cho thấy rõ ràng rằng Sulforaphane làm giảm độc tính Cd trong hMSCs. Ngoài ra, kết quả phân tích biểu hiện gen và nhuộm LysoRed cũng xác nhận rằng Sulforaphane làm giảm độc tính Cd trong hMSCs.
Sulforaphane là một chất chống oxy hóa tiềm năng có thể loại bỏ các loại oxy phản ứng do Cd gây ratrong hMSCs thông qua cơ chế trung gian ty thể. Cytochrome C được tìm thấy trong màng trong của ti thể, đóng vai trò chính trong quá trình apoptosis. Sự biểu hiện gen CYCS Các gen MDM2, ATM, XRCC1, POR, TNFRSF1A và TNFSF10 được điều chỉnh đáng kể trong các hMSC được đồng xử lý với Cd-Sulforaphane. Các gen TNFRSF1A và TNFSF10 điều chỉnh quá trình chết theo quá trình apoptosis, sự tồn tại của tế bào và chứng viêm.
TNFSF10 là một protein cytokine gây ra quá trình apoptosis ở các tế bào ung thư thông qua việc kích hoạt MAPK8 / JNK, caspase 8 và caspase 3. Tuy nhiên, một số nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy rằng TNFSF10 dường như không gây độc cho các tế bào bình thường trong khi nó biểu hiện quá mức một cách đáng kể. Mức độ biểu hiện gen TNFSF10 tăng lên đáng kể sau khi đồng điều trị Cd và Sulforaphane do giảm độc tính của Cd trong hMSCs bình thường. Hệ thống P450 / POR đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế giải độc. Cytochrome P450 oxidoreductase (POR) là chất cho điện tử bắt buộc đối với tất cả các enzym cytochrom P450 ở microsome đòi hỏi hoạt động bình thường của hơn 50 enzym trong họ cytochrom P450. Các enzym nhận điện tử này (CYPs hoặc microsome p450 s) có thể phân hủy và giải độc một số hợp chất nội sinh và ngoại sinh.
Trong nghiên cứu này, điều trị kết hợp Cd + sulf làm tăng đáng kể POR mức độ biểu hiện hơn Cd và Sulforaphane đơn thuần. Do tác dụng hiệp đồng này, Cd có thể bị vô hiệu hóa bởi hệ thống P450 / POR, trực tiếp hoặc bằng cách bài tiết thuận lợi ra khỏi cơ thể. Yang và cộng sự báo cáo rằng điều trị bằng Sulforaphane nâng cao chất lượng tinh trùng và mức độ chất chống oxy hóa sau khi điều trị Cd bằng cách tăng biểu hiện của γ-glutamyl cysteine synthetase-, yếu tố liên quan đến yếu tố hạt nhân-erythroid 2, yếu tố liên quan đến heme oxygenase-1-, và glutathione peroxidase- mã hóa gen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan sát thấy sự điều hòa biểu hiện gen POR sau khi đồng xử lý Cd và Sulforaphane đối với hMSCs được cho là do chuyển hóa Cd. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng Sulforaphane điều chỉnh kiểu biểu hiện gen trong các hMSC được xử lý bằng Cd.
Kết luận, đồng điều trị Cd và Sulforaphane điều chỉnh hình thái hạt nhân, MMP và các kiểu biểu hiện gen trong hMSCs khi so sánh với việc điều trị chỉ với Cd hoặc Sulforaphane. Nhìn chung, những phát hiện này cho thấy rằng ăn các loại rau có chứa Sulforaphane có thể giúp giảm độc tính Cd.
4. Các chủ đề liên quan
Dưới đây là một số bài viết về các chủ đề nghiên cứu có liên quan đến hoạt chất Sulforaphane và công dụng của chúng:
- Chế độ ăn uống có chiết xuất bông cải xanh giàu Sulforaphane giúp bảo vệ tim khỏi căng thẳng tim cấp tính
- Tác dụng bảo vệ của chiết xuất bông cải xanh và Sulforaphane chống lại sự căng thẳng oxy hóa
- Sulforaphane : Một sản phẩm tự nhiên chống lại các loại oxy phản ứng
5. Tham vấn chuyên môn
- Bác sĩ
- Nguồn tham khảo: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332218338617